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        实验新手求救,太神奇了竟然跑不出来。。。

        相关实验:反向 PCR (inverse-PCR)

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        dxy_i4udmwk5

        请大神指导,为什么第一次PCR跑出了条带,第二次第三次就都跑不出来,反应体系,反应条件,引物、模板都是一样的,就是跑不出来,请问都有哪些因素可能影响了呢

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        4 个回答

        user-title

        bamboopiggy

        有帮助

        你的模版怎么保存的?一般这种情况考虑模版降解了

        user-title

        dxyc42u

        有帮助

        先从源头排除,模板什么时候提的?有没有降解可以跑胶看一下。引物设计有没有问题?看你的Tm值有点偏低,不知引物多长?下次设计引物时可以适当加长几个碱基,退火温度尽量不要太低,一般维持在55℃左右最佳,当然这个不绝对。还有酶和buffer的问题,这个最容易排除,比如全换新的,或者找一个你确定没问题的引物和模板做个对照,也能排除问题。至于跑胶的问题,这个更容易,看marker正不正常就行了。

        user-title

        huarenqiang5

        有帮助

        可能是模板浓度过高或者过低,降解,或者是模板中杂质过多,或者是模板被污染(抑制剂,或者提DNA有东西没除干净,或者外来污染),或者是DNA没提好(片段被打碎,质量差等等),或者是反应条件不是最优条件,质量稍差的模板难扩出来。

        user-title

        土井挞克树

        有帮助

        可能是你的底物变性了,所以跑不出来。

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