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        反向PCR

        相关实验:反向 PCR (inverse-PCR)

        最新修订时间:

        原理

        反向PCR可用于研究与已知DNA区段相连接的未知染色体序列,因此又可称为染色体缓移或染色体步移。这时选择的引物虽然与核心DNA区两末端序列互补,但两引物3’端是相互反向的。扩增前先用限制性内切酶酶切样品DNA,然后用DNA连接酶连接成一个环状DNA分子,通过反向PCR扩增引物的上游片段和下游片段;现已制备了酵母人工染色体(YAC)大的线状DNA片段的杂交探针,这对于转座子插入序列的确定和基因库染色体上DNA片段序列的识别十分重要。

        材料与仪器

        步骤

        一、限制性内切酶消化
         
        1.  选择合适的限制性内切酶,基因组一定要切成弥散性的条带。在酶切之前,应对基因组DNA定量。
         
        2.  根据T-DNA的左边界序列选择合适的酶切位点EcoRI,BamHI和HindIII/PstI,并在酶切位点上游附近设计引物Z1,Z2,Z3和Z4,然后用这些内切酶分别消化基因组DNA,酶切体系如下:
         
        反向PCR

        37℃ 过夜,电泳检测酶切效果。

        二、回收DNA
         
        1.   将酶切产物转到1.5 ml离心管中,用ddH2O洗涤干净,并稀释到250 ul;
         
        2.   加入等体积的酚和氯仿(V:V=1:1),涡旋混匀,室温静置1 min;
         
        3.  最大速度(13 000 rpm)离心1 min;
         
        4.   将上清移到另一管中,加入等体积的氯仿,涡旋混匀,室温静置1 min;
         
        5.   最大速度(13 000 rpm)离心2 min;
         
        6.   将上清移到另一管中,加入2.5倍体积的-20℃预冷的无水乙醇,0.1倍体积的3 M 乙酸钠(pH=5.2),轻轻振荡混匀,室温静置5 min;
         
        7.   4℃最大速度(13 000 rpm)离心10~15 min;
         
        8.   弃上清,尽量除去管壁上的液体;
         
        9.   加入1 ml -20℃预冷的70%乙醇,轻轻颠倒几次。最大速度(13 000 rpm)离心5 min;
         
        10.   除去乙醇,在超净台上平放,将管壁上的乙醇挥发掉,20~40 ul ddH2O溶解。-20℃保存。
         
        三、连接

        1.  体系如下:
        反向PCR
        2-14℃   过夜
        2.  连接体系比较大,而DNA含量比较低,不需加入PEG4000,这样可以促进分子内的连接,减少分子间的连接。试验中我们采取蹇文婴等(2002)的方法(12-14℃连接48 h)。连接完成后,65℃ 水浴10 min灭活。按上述3.抽提回收,溶解于40 ul ddH2O中。
         
        3.  然后就可以用回收的链接片段做PCR了。

        注意事项

        1. 需要从许多酶中选择合适限制酶,或者说必须选择一种合适的酶进行酶切才能得到合理大小的DNA片段。这种选择不能在非酶切位点切断靶DNA。


        2. 基因组DNA必须酶切完全。


        3. 为提高分子间连接的效率,连接反应中DNA的浓度要低,因为高浓度的DNA可能会提高非同源连接水平,从而产生非特异性扩增。


        4. 成环的cDNA进行裂解和变性比较重要,因为环状双链DNA分子易于形成超螺旋而不利于PCR反应,它只可以扩增出较短的DNA片段。


        5. 碱变性法已成功地用于制备PCR和测序DNA,该方法也可以有效地使环化的双链cDNA实现变性。

        来源:丁香实验

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