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科研学霸天团,48小时有问必答
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问
从琼脂糖凝胶中纯化 PCR 片段时,缺口的DNA 有点多,已经减少对凝肢的照射时间了,还有别的办法能增加成功的DNA环吗?
bamboopiggy
你是说你pcr 的DNA胶回收以后,DNA突变多么?可以考虑是不是模板的问题。
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问
PCR 请问各位学术高手
dxy_g9y5gije
你先尝试一下逐渐放大根据你的条件,我觉得可能是50体系引物太少或者酶太少,导致产物含量少,所以感觉没有PCR出来,实际上是有产物的
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问
求助贴 科研小白进入瓶颈期
灵枢天问
你要不要考虑换个抗体试试😂 ,或者在组织里试一下
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问
PCR的酶如何选择,冰箱里有Taq酶,primerstar酶,还有高保真酶,有的产物是平末端,有的带A,这是怎么回事啊?
dxy_jrj59zn3
看你的PCR实验要求,如果要求准确度高的话,就用高保真酶,primerstar应该也是高保真酶的一种吧,比如说你后续要测序,然后构表达载体,就最好是有准确度高一点的PCR产物。
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问
荧光定量PCR时应该注意什么?
Eason老歌迷
它的关键步骤在于RNA的抽提和引物的设计。RNA的抽提需要严格进行RNase free的操作,抽提的RNA OD260/OD280需严格控制在1.9-2.1之间。引物设计主要的考虑是其PCR反应特异性好和扩增效率高,进行PCR反应时无非特异性的条带和引物聚合体出现,尽量选取GC含量在40-60%的区段进行扩增。另外,还需要适应荧光定量PCR仪上机条件的设定,退火温度在55-65℃之间。除此之外,其
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问
如何防止pcr形成引物二聚体
Eason老歌迷
引物二聚体其实就是一对引物或者引物自身的 3’ 端部分碱基互补结合,在 Taq 酶的作用下从 3’ 末端延伸所形成的小分子量的双链 DNA 片段。可以通过下面的方法来进行:比如说重新设计引物,增加模板用量,减小引物浓度,引物长度适中,提高退火温度,减少循环次数等等。
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问
PCR实验室如何避免产生污染导致结果假阳性?
bamboopiggy
严格遵守操作规范,彻底隔离有DNA的区域和无DNA的区域
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问
反应后,为什么没有曲线出现
bamboopiggy
模板没有加进去?pcr的mix没配全?机器有问题?
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问
RNA提取后进行逆转录,引物扩增后跑胶发现没有条带,可能的原因是什么?
bamboopiggy
rna反转录不成功,引物不特异,机器有问题,产物太小,可能需要用page胶。
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问
一个基因需要纯化后的模板才能批出来,一个基因粗提的模板可以批出来,一个体系同时批这两个基因,为什么需要纯化的模板的条带反而更亮
bamboopiggy
因为纯化的模板更干净,没有杂七杂八的影响pcr过程啊
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问
pcr时一个体系放2对引物,为什么一个带强,一个带弱,是需要特殊的反应体系吗,单独批条带都很亮
bamboopiggy
因为那个亮的带的引物结合能量更强,或者是亮的那条带短,没事
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问
小鼠基因型鉴定,pcr时不仅出现目地条带还出现一条杂带,梯度pcr时仍出现,比较诡异,想问下原因
bamboopiggy
没事是非特异性结合,鼠尾毕竟不是dna,没那么干净
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问
目前哪种高保真酶pcr保真度最好?后续用于NGS建库测序
bamboopiggy
只要标了高保真的都可以,现在的酶都好使
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问
pcr时,扩增>5000bp片段。使用普通taq酶,还是高保真酶,更容易扩增出来?
灵枢天问
高保真酶啊,你这个片段也挺长的
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问
qPCR,探针同一种探针,标不同颜色,灵敏度是否有影响?
bamboopiggy
都一样,这个取决于探针的序列,啥颜色都可以
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问
qPCR平台期时,曲线呈现锯齿状,模板是质粒
bamboopiggy
可能是机器需要校正了,叫工程师来校一下
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问
RT-PCR的时候96孔板加样容易出错,漏加重复加加错位置等,有什么小技巧避免?
balalaLy
可以用Marker笔在板上面划线,不要污染到孔就行,还有就是加样的时候把样品打到孔的侧壁,可以看得到,每加完一种就调整一下板的位置,这样每次加的东西都打到侧壁的不同位置,避免污染枪头,不用每加一个孔换一个枪头。
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问
重叠pcr接头的设计是优先长度还是tm值?
bamboopiggy
先管重叠接头的长度,tm值可以优化
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问
PCR结果条带大小与结果不符,或者目的条带假阳性怎么处理?
bamboopiggy
重新扩增,或者重新设计引物,改扩增程序,做好阴性阳性对照
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问
扩增产物在凝胶中涂布或成片状条带弥散是什么原因?
未来9
扩增产物在凝胶中涂布或成片状条带弥散可以从以下几方面找找原因呢。(1)酶量过高。减少酶量;酶的质量差,调换另一来源的酶。(2)dNTP浓度过高。减少dNTP的浓度。(3)MgCl2浓度过高。可适当降低其用量。(4)模板量过多。质粒DNA的用量应<50ng,而基因组DNA则应<200ng。(5)引物浓度不够优化。对引物进行梯度稀释重复PCR反应。(6)循环次数过多;增加模板量减少循环次数
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