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科研学霸天团，48小时有问必答

问在进行线粒体DNA PCR扩增时用限制酶酶切有什么作用，除了分段，获得目的的DNA还有别的吗？

bamboopiggy

不知道你的实验目的，但是一般酶切就是为了分开或者验证什么。

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问乙肝病毒荧光定量多少正常？

汤姆卜丽波

乙肝病毒荧光定量也就是PCR检测，正常值小于100IU/ml，如果大于100IU/ml，就是阳性的结果，也就是携带了乙肝病毒。

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问荧光定量pcr检测解脲支原体dna阳性说明什么？

秋秋欣欣

解脲支原体阳性，提示存在解脲支原体的污染

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问怎么确定很好的荧光定量PCR的引物，具体看哪些参数进行区分呢？

汤姆卜丽波

引物最好位于编码区5’端的300-400bp,无二级结构（自由能小于58.61KJ/mol），长度一般在17-25碱基之间，G+C含量45-55％，TM58-62

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问请问克隆引物和qPCR引物有什么区别，可以用qPCR引物做基因克隆用吗？

bamboopiggy

看你的实验目的，克隆的引物一般是在基因的起始和结尾设计，但是qPCR的引物的产物一般是50-200bp左右的，如果你要克隆50-200bp左右的片段，就可以用qPCR的引物。

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问请问qPCR引物合成出来大概多久内要用完？怎么样验证一下我放了很久的qPCR引物是否还可以用？

天一湖医者

如果放入-20度的话，可以一年。

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问请问我的目的基因的本身GC含量就比较高，该怎么样设计克隆引物？

秋秋欣欣

克隆引物就正常设计就可以，退火温度可稍微设置高一点

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问荧光定量的标准曲线是否是必需的？

天一湖医者

荧光定量的标准曲线是非常必需的。

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问qPCR曲线形状解释

汤姆卜丽波

模板浓度太高了，在基线期内就起峰了，仪器会默认起峰的线条仍为基线部分，将扩增曲线往基线位置下拉，因此你的曲线下滑，这种情况大家也不要慌，可以减小基线终点（例如基线期默认 3 - 15 个循环，改为 3 - 10 个循环），重新分析数据，一般都能得到一个比较好的结果

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问PCR条带弥散严重，怎么解决呢？

天一湖医者

1.酶量过高。减少酶量;酶的质量差,调换另一来源的酶。2.dNTP浓度过高。减少dNTP的浓度。3.MgCl2浓度过高。可适当降低其用量。4.模板量过多。质粒DNA的用量应<50ng,而基因组DNA则应<200ng。

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问1.引物二聚体严重是怎么回事？2.CT值偏大（CT值的大于等于30）是什么原因呢？3.体系双扩增的原因？

天一湖医者

引物设计不合理，两条或一条引物的3`端有互补序列，造成自己配对延伸而扩增。建议重新设计引物，，或者降低退火温度、增加模板和引物的量试下。

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问无特异性扩增，全为引物二聚体是怎么回事？

李小栋UI65

引物效果不好可能是由于引物间存在互补序列

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问PCR求助

bamboopiggy

你这不是正常的melt curve，数据不能用了。找一下原因，是试剂还是机器的原因。

4 回答356 围观

问UCSC验证别人已发表文献的引物出现no match，什么原因？

bamboopiggy

是不是方向问题？有的软件要求reverse方向的引物要反向互补才能对比上

3 回答506 围观

问OT-1和OT-2小鼠的鉴定

bamboopiggy

OT-1小鼠是体内CD8+T特异性识别OVA，OT-2小鼠是体内CD4+T特异性识别OVAOT-1 的原始参考文献，Enhancement of Adaptive Immunity by the Human Vaccine Adjuvant AS01 Depends on Activated Dendritic Cells 以及另外一篇文献：Quantitative PCR for detecti

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问Taqman探针怎么设计？荧光基团怎么选择？

未来9

探针设计的基本原则：1．保守：探针要绝对的保守，有时分型就单独依靠探针来决定。理论上有一个碱基不配对，就可能检测不出来。若找不到完全保守的片段，也只能选取有一个碱基不同的片段。且这个不同的碱基最好在探针的中间，对探针与目的片段的杂交影响不大，不相同的碱基最好不要在两端，因为两端不利于探针的杂交。且最好为A或T，而不能为G或A，因为A、T为双键，而G、A为三键。2．探针长度Taqman探针的长度

4 回答1531 围观

问弱弱的问一句，所以文献中经常看到的qRT-PCR就是Real-time RT-PCR（RT-qPCR）吗？

whilt-shirt

是的，qRT-PCR就是Real-time RT-PCR

4 回答7447 围观

问请问普通PCR一般退火温度大致在多少范围？是否可根据实际情况微调？

bamboopiggy

退火温度以55度为起始，一般是primer的low temperature-5,要是不低于55，就可以用

4 回答1603 围观

问同一个批号的质控，同一天用，有的批次质控测不出o基因，有的又能测出o基因，请问是质控问题还是仪器问题？

大草原的小灰驴

有的批次质控能测出目的基因而有的测不出，这种情况的出现是否与质控品保存条件有关呢？质控品在紫外线下照射应该影响不大，因为紫外线的穿透能力比较弱，适用于物体表面的消毒。但是常温保存肯定会影响检测结果，因为质控品的稳定性较差，应当严格按照说明书的条件保存，并在有效期内使用。另外如果质控品量比较大而每次使用的量较少，应该分装后保存，避免反复冻融。

5 回答501 围观

问请问大家，qPCR 的CT值在30多是正常的吗？

bamboopiggy

ct值在30多，目的基因可以，但是内参不行

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