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        pcr产物双酶切后连接只长出原载体,请问哪里出了问题

        相关实验:🔥 分子克隆技术

        user-title

        ddlyy

        我想通过两次pcr分别获得载体片段和目的片段,然后分别进行双酶切,再t4连接,连接后电泳显示多个连接产物条带,转化以后长出来的菌提质粒pcr不成功只能p出杂带,选择直接质粒电泳结果全部都和原载体一样,(我的质粒是低拷贝,提完质粒浓度不够测序图片描述


        左边的六个是重组子提质粒电泳结果,第七个是原载体质粒电泳(7kbp),右边七个是质粒pcr结果全都在2000的位置有一个杂带

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        3 个回答

        user-title

        周末也要努力呀

        有帮助

        推测可能出现以下几种情况:


        1. PCR产物没有成功双酶切:请确保PCR产物已经成功进行了酶切反应,并且使用了正确的酶切酶和相应的缓冲液。


        2. 双酶切产物没有经过凝胶电泳纯化:在连接之前,需要将双酶切产物进行凝胶电泳分离,并纯化目标片段,以去除其他杂质。


        3. 连接反应条件不正确:连接反应需要使用适当的连接酶和缓冲液,并在正确的温度和时间下进行。请确保连接反应条件正确。



        user-title

        ddlyyuser-title

        请问双酶切后使用柱回收可以吗,胶回收之前做过,回收效率太低,尝尝测不出来浓度,或者有什么办法提高胶回收效率吗

        user-title

        高山云初

        有帮助

        引物设计不合理或者模板DNA的污染或降解 

        user-title

        ddlyyuser-title

        主要是我模板在左边的电泳里看着也没什么污染,但是条带基本就两条,奇怪的是超螺旋跑的太快,我7k的质粒跑出来显示2k的条带,搞不清楚是为什么

        user-title

        粥辰辰辰辰

        有帮助

        在进行PCR扩增时候,给引物两端设计好酶切位点,一般说来,限制酶的选择非常重要,尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶。选好酶切位点后,在各个酶的两边加上保护碱基

        user-title

        ddlyyuser-title

        保护碱基我就按照网上搜到的加的,而且我过夜酶切,连接以后我还跑了电泳看连接效果,结果显示有一些连接上了,但是显示有多个连接产物也有点弄不清为什么,连接后电泳图我也放一下图片描述

        右边的在5kbp左右的就是我的连接产物,但是呈现多条带,不知道为啥


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