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        race实验中特异性引物如何设计?有没有什么判断标准?

        相关实验:cDNA 3'末端的快速扩增(3’-RACE)

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        2 个回答

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        Miracle星

        有帮助

        引物设计

        使用锁定引物(lock docking primer):在oligo(dT)引物的3′端引入两个简并的核苷酸MN(结构为5′-oligo(dT)16-30MN-3′,M=A/G/C;N=A/T/C/G)。使用锁定引物可使引物定位在poly(A)起始位点,消除了在合成第一条cDNA链时oligo(dT)与poly(A)尾的任何部位结合所带来的影响。

        3′RACE以3′末端的poly(A)序列设计逆转录引物时,使用oligo(dT)和一段接头序列作为引物(图1),这样就在cDNA末端接上了一段特殊的接头序列,在得到第一条cDNA链之后,依据接头序列设计基因特异性引物,如此则后续的PCR扩增中一对引物均为基因特异性引物,可以有效提高扩增的特异性。

        5′RACE在以第一条cDNA链3′末端的poly(C)计扩增引物时,使用poly(G)和一段接头序列作为引物(图2),在第二条cDNA链后接入一段特殊的接头序列。依据接头序列设计基因特异性引物,并用此引物与根据已知cDNA序列设计的基因特异性引物作为一对引物进行PCR扩增。

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        Eason老歌迷

        有帮助

        race实验设计引物的要求:引物长度以20-28 nt为宜。引物中的GC含量一般为45%-55%,GC、AT分布均匀,应尽量避免局部富含GC或AT。引物最好不形成二级结构(发夹结构等),与5′RACE Outer Primer和5′RACE Inner Primer不能形成复杂结构。引物3′端的3~4个碱基不要与配对引物形成互补序列.

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