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        3’5’race具体操作步骤与原理

        相关实验:cDNA 3'末端的快速扩增(3’-RACE)

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        2 个回答

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        Miracle星

        有帮助

        3′RACE

        RACE的实验样本包括总RNA,poly(A)+RNA等。首先根据mRNA3′末端天然存在的Poly(A)尾部设计反转录引物逆转录获得第一条cDNA链。根据已知的cDNA序列设计基因特异性引物(gene specific primer,GSP)合成第二条cDNA链。随后以基因特异性引物(GSP)及正义链3′末端引物作为一对引物,对得到的cDNA链进行PCR扩增,从而得到cDNA的3′端序列(基因特异性引物→3′末端)

        5′RACE

        根据已知的cDNA序列设计基因特异引物(GSP),逆转录获得第一条cDNA链,同时用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)在cDNA3′端加Poly(C)尾。依据Poly(C)尾设计特定引物合成第二条cDNA链。随后以第二条cDNA链为模板利用基因特异性引物合成双链cDNA。最后以基因特异性引物(GSP)及反义链3′末端引物为一对引物进行PCR扩增获得cDNA5′端序列(基因特异性引物→5′

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        Eason老歌迷

        有帮助

        先利用mRNA的3'末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点,以Oligo(dT)30MN作为锁定引物在反转录酶MMLV作用下,反转录合成标准第一链cDNA.利用该反转录酶具有的末端转移酶活性,在反转录达到第一链的5'末端时自动加上3-5个(dC)残基,退火后(dC)残基与含有SMART寡核苷酸序列Oliogo(dG)通用接头引物配对后,转换为以SMART序列为模板继续延伸而连上通用接头。然后用一个含有部分接头序列的通用引物UPM(universal primer,UPM)作为上游引物,用一个基因特异引物2(GSP 2 genespecific primer,GSP)作为下游引物,以SMART第一链cDNA为模板,进行PCR循环,把目的基因5'末端的cDNA片段扩增出来。最终,从2个有相互重叠序列的3'/ 5'-RACE产物中获得全长cDNA,或者通过分析RACE产物的3'和5'端序列,合成相应引物扩增出全长cDNA。

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