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科研学霸天团，48小时有问必答

问3’5’race具体操作步骤与原理

Miracle星

3′RACERACE的实验样本包括总RNA，poly(A)+RNA等。首先根据mRNA3′末端天然存在的Poly(A)尾部设计反转录引物逆转录获得第一条cDNA链。根据已知的cDNA序列设计基因特异性引物(gene specific primer,GSP)合成第二条cDNA链。随后以基因特异性引物(GSP)及正义链3′末端引物作为一对引物，对得到的cDNA链进行PCR扩增，从而得到cDNA的3′端

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问核酸阳性质控VIC通道基因不起，内参和FAM通道基因表达的原因

哈哈好久

最好重新做一次，找能确定起的阳性再来一次，不然光一次无法确定是你操作还是什么原因

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问【求助】几个样本都这样，A260/280＞2.3，A260/230在1.1左右

bamboopiggy

在 pH7-8.5 下 A260 / A280 的比值应该在 2.0 或 2.5，所以你260/280问题不大，问题是260/230，感觉就是你的乙醇没有晾干，然后你rna 的实际浓度可能和你测出来的有出入，所以你可以试试做一下下一步的实验

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问请问荧光素酶实验时，对细胞密度有要求吗？

bamboopiggy

有，按照你用的荧光素酶公司的protocol来做，否则太低，可能测不出差异

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问求助基因多态性测定

dxy_jf8hxwe2

三个位点的分型检测适合用Sanger测序进行检测，可以直接送血样到测序公司，直接给你返回检测结果和基础分析

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问细胞敲低过表达问题咨询

bamboopiggy

做转录因子和下游靶基因的关系，应该用chip或者是luciferase实验来验证，不是敲低和过表达来验证的。

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问蛋白点晶应该如何选择纯化标签

Eason老歌迷

常用的标签有6×His标签、MBP标签、GST标签、SUMO标签等。这些标签各具特色，在选择标签时，需要先了解目的蛋白和标签的特点。

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问紧急求助提质粒

申东熙老伯

你提的质粒是氨苄抗性的吗？如果是氨苄抗性的话，很有可能是转化后平板培养太久出现了卫星菌落，虽然有抗性但是没有质粒。

3 回答374 围观

问有没有大神做跳跃外显子形成的circ

Eason老歌迷

可能是起始外显子和终止外显子之间有多个内含子和外显子。预测环状RNA时，只能够确定起始外显子和终止外显子，却不能确定在该circRNA中间到底有哪几个外显子，而且到底包不包含内含子序列，由于可变剪切的存在，可能存在多个外显子，也可能包含内含子，是不能够准确的提取circRNA对应的序列；能够做的只是将包括起始外显子和终止外显子以及之间的所有外显子连起来作为circRNA的序列。

1 回答232 围观

问动物肝癌细胞H22稳转

bamboopiggy

是不是你的基因的问题，过表达会增加血管的通透性，而敲低，会降低血管通透性。

1 回答390 围观

问CRISPR敲除导致基因组非目的基因丢失怎么办？

Eason老歌迷

我建议你如果有很多基因丢失，你必须要再做一次了。crispr方法会产生丢失现象，具体参看这篇文章，Paul Q. Thomas 等人在 Nature 发表的一篇题为：Large deletions induced by Cas9 cleavage 论文显示，CRISPR/Cas9切割后小鼠受精卵中出现频繁的大量碱基缺失（千碱基量级）

2 回答348 围观

问miRNA可以跑凝胶电泳吗？

bamboopiggy

可以跑，但是要用page胶，琼脂糖无法检测到。

3 回答622 围观

问高分子材料水凝胶包埋蛋白，计算包封率时，游离的蛋白如何定量比较准确？

Eason老歌迷

我用的是差量法。蛋白质投加量减去洗涤液中的蛋白质含量（即没有包埋进去的蛋白质）。测蛋白的方法--分光光度发，我知道的有两种。一种是修正的Lorry法，另一种是考马斯亮蓝法。我用的Lorry法。

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问如何在细胞水平证明巨噬细胞中一个基因的功能？

荒诞小说

raw转质粒好转吗？我实验室的师姐说这个细胞基本转不好质粒。她后面用的是慢病毒。你可以参考一下。

3 回答482 围观

问什么情况下要做ChIP-seq，什么情况下做EMSA？两者有何区别？

bamboopiggy

chip-seq得到的数据比较多，emsa可以对chip-seq找到的序列进行验证，最好两个都做。

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问重组质粒不表达，什么原因？

Eason老歌迷

菌落PCR的假阳性非常高，应该挑取多个阳性菌株，加入抗生素小摇之后将菌液送去测序，然后再选取正确的菌株进行重组表达，因为，还有可能存在载体上根本没有目的基因的情况，当然就不表达了

3 回答840 围观

问如果circRNA的引物既可以扩增出环状RNA，又可以扩增出线性RNA

Eason老歌迷

RNase R检测并非是必须的，但可以作为一个很典型的实验证明和鉴定circRNA。RNase R主要用于circRNA的鉴定和富集实验，需要根据具体的实验内容和目的决定是否进行RNase R消化。如果是以qPCR进行定量检测，一般可以不做RNase R检测，即不需要对circRNA进行富集（线性RNA被消化）。

1 回答644 围观

问fish技术是基因扩增吗？

天一湖医者

是的，荧光原位杂交技术（FISH）是目前临床病理诊断中一种重要的辅助技术，主要用于基因的扩增、易位和融合，在淋巴造血系统和软组织肿瘤中应该较为广泛。

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问我想问一下，双CART的构建是构建两种病毒还是构建一个包含两个基因的病毒好？有老师说两个病毒的话会影响转染效率

Eason老歌迷

后一种更好。确实如你老师所言，两个病毒的话会影响转染效率。

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问请问有人在用CAR慢病毒转染Jurkat 细胞吗？为什么转染之后扩增这么难，还死了一大片。

Eason老歌迷

正常，这跟细胞上病毒受体表达的多寡以及细胞的抗病毒能力有关，这两个原因一般无法克服。给提供几个常见的解决方法。一个是加助侵染试剂。二是浓缩病毒，4摄氏度，10K蛋白截留柱离心浓缩，提高病毒滴度后在感染，可以提高感染阳性率。三是分选阳性细胞，一般情况下，慢病毒感染Jurket、THP1这种有免疫能力（指的是分子免疫抗病毒能力）的细胞，基本上不可能做到100%感染，如果你感染以后有分选标签，做一个流式

2 回答1040 围观

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