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科研学霸天团，48小时有问必答

问本人纯化his标签蛋白，无论如何更换表达感受态和诱导条件，蛋白表达量都很低是什么原因？使用载体为32a，和28a都不理想

天一湖医者

a可能原因：超声功率不合适(太大，蛋白碳化，太小，蛋白没完全释放)解决方法：改变超声功率或者其它方法破碎细胞。b.样品或缓冲液不合适解决方法：确保缓冲液中螯合剂，还原剂，咪唑浓度不是很高。c.His标签暴露不完全解决方法：在缓冲液中加变性剂(4-8M尿素，4-6M盐酸胍)，然后用IMAC介质纯化。d.His标签丢失解决方法：必要时增加His的个数并确保正确表达，同时降低上样速度，确保足够的孵育时间

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问常用的蛋白纯化标签有什么特点？如何选择？

未来9

蛋白标签大体可分为三大类：遗传标签、in vivo标签和in vitro标签，最为常用的是遗传标签，即c-Myc、FLAG等。通过将目的基因克隆到含有标签的载体上，方便在下游通过抗体、荧光检测蛋白，或对蛋白进行纯化如何选择：1. 首先需要确定融合标签的目的，蛋白纯化首选His-Tag，Western blot首选Flag-Tag，免疫共沉淀可选择Flag-Tag或其他常用标签如HA、cMyc，活细

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问蛋白质提取纯化实验中，第一步在原材料中加缓冲盐溶液体积如何确定？提取环境温度设在多少合适？

万千490

稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1-5倍，提取时需要均匀的搅拌，以利于蛋白质的溶解。提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这一点考虑提取蛋白质和酶时一般采用低温（5度以下）操作。为了避免蛋白质提取过程中的降

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问请问果汁有机酸含量测定这个实验怎么做？

迟C迟

请参考GB 5009.157-2016，食品中有机酸含量测定有详细步骤。

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问提高细胞支架材料的粘度性方式有哪些？

dxy_gwrp7ndq

最适合细胞粘附、增殖的材料表面应为中等湿润。运用等离子体表面改性技术，在高度疏水的P3/4HB 支架表面引入-OH、-COOH等基团，将材料表面的湿润度改善为中度亲水，为促进细胞的粘附创造了有利条件。

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问外泌体的生物记物是什么？

bamboopiggy

1.电镜检测：茶托型或一侧凹陷的半球形2.Western blot分子标志物检测：外泌体标志蛋白包括四跨膜蛋白家族，如CD9、CD63和CD81；细胞质蛋白，如肌动蛋白（Actin）和钙磷脂结合蛋白（Annexins）；参与生物功能的分子，如凋亡转接基因2互作蛋白X（ALIX）、肿瘤易感基因101蛋白（TSG101）、热休克蛋白（HSP70、HSP90），以及细胞分泌的特异性蛋白

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问白色脂肪组织是由于那些因子而可以转化为棕色脂肪组织的呢

bamboopiggy

FGF21、PGC-1α、UCP1、PRDM16、ATGL、AMPK、PPARγ、脂连素等，都会促进白色脂肪棕色化。你可以直接找个综述来看看。

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问请问大家都是怎么做小分子抑制剂找通路或者靶点的？最佳使用浓度怎么确定？

bamboopiggy

现在可以通过买一些公司的药物库，直接高通量筛选，有用的小分子药物。一般是高通量10um的药物浓度，筛出有用的小分子化合物以后。再扩大浓度梯度，找到合适的浓度，至于小分子药对应的靶点，一般文献里，或公司给的说明书里会有，selleck应该就有这样的药物库

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问Qupath软件的使用方法？

bamboopiggy

我没有用过这个软件，但是看你提了，我好奇是个什么软件，原始链接在这里，你可以直接点链接去看看：https://blog.csdn.net/qq_40662074/article/details/104968297这个帖子包含了以下内容：软件安装软件下载软件安装【windows版】简单使用文件打开人工标注标注导出和导入几个重要的官方说明书

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问病毒反向遗传操作的比例是如何确定的？

dxywode

RNA病毒的反向遗传学操作是指由病毒的cDNA克隆获取RNA病毒的一项技术,该技术通过人为加入的DNA环节,实现了在DNA水平上对RNA 病毒基因组的人工操作,在深入阐明病毒基因组结构与功能、发展新型病毒载体,尤其在研制筛选候选疫苗株等方面有很好的应用前景.用PBS液洗3次，按照1:6比例。

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问以EDC和NHS做催化剂，TPGS-COOH和4-NH2－Tempo为原料，二者发生酰胺反应。

丁香粉猪猪

ph值4缓冲液体中，反应48小时室温

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问病毒感染和CRP的关系是什么，降低是不是就算愈后良好？

府宅

在病毒感染时，没有显著提高，通常≤50mg/L，如果 CRP 值显著下降，证明疗效良好。

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问导致实时荧光定量 PCR 效率低有哪些原因？

dxy_gwrp7ndq

1. PCR反应性能差。引物、试剂、PCR条件的再摸索。优化反应条件，或者重新设计PCR引物。2. PCR阻害物质的混入。模板提取方法的再摸索。3. 标准品稀释不准确。使用专用标准品稀释Buffer。

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问酶联免疫封闭剂可以用纯生物素吗？不封闭对结果有影响吗

府宅

不可以用纯生物素，一般是使用生物素标记抗体，它和酶的标记率高，又不影响蛋白的活性。

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问对于荧光直标抗体，如何设计实验对照？

小布丁瑶瑶

1、直接法（1）标本自发荧光对照标本只加PBS或缓冲甘油封片，荧光显微镜观察组织内如果有荧光，称为自发荧光。（2）抑制试验可分为一步方法和二步方法。一步抑制方法：先将荧光抗体与过量未标记特异性抗体作等量混合，再加在标本上染色，结果应为阴性。二步抑制方法：标本先加未标记的特异性抗体，水洗后再加标记荧光抗体，结果应呈阴性或明显减弱的荧光。（3）阳性对照用已知阳性标本做直接法免疫荧光组织

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问RNA的提取原理是什么？

小布丁瑶瑶

RnA提取原理：Trizol是一种总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速裂解细胞，抑制细胞释放出的核酸酶活性。目前常用Trizol法进行提取组织或细胞中的RNA。

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问EDTA不小心弄到皮肤上，眼睛里，嘴里应该怎么办？

Kimser

EDTA用于福尔马林固定、石蜡包埋组织切片免疫组织化学染色前的抗原修复。虽然其ph是9，不过一般使用时都是稀释过的，所以危害不大，一旦进入眼睛或皮肤，先用大量流动自来水冲洗一段时间后再就医检查。注意防护，戴好手套和护目镜等，也可以换用柠檬酸缓冲液。

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问请问一下，有人做过羧化的TPGS与TEMPO发生酰胺反应吗？我采用的是EDC做催化剂，DMSO做溶剂，不知道为啥合不出来?

dxywode

根据反应的机理，是edc和hobt先和酸反应，然后是胺进攻而生成最终的产物酰胺。我认为最好是先加rcooh和edc、hobt让他们反应半个小时后。再加入胺。你也可以加点dmap，我认为它一方面是催化剂，另一方面它也起到了提供碱性的作用。我们实验室的经验是1当量酸+1当量edc+0.5当量dmap+1当量hobt，反应半小时后加入1.2当量胺，然后室温搅拌tlc跟踪反应。这种类型的反应有的几个小时就

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问双光素酶报告实验验证靶基因

迟C迟

双荧光素酶报告实验检测灵敏度很跳，酶标仪检测出来的数值就算是重复孔之间差异有时候都是数量级的差别。建议用不一样的实验系统再次验证实验结果。

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问mRNA药物在早期研发时，做动物/人体实验之前，需要做细胞水平的检测吗？

迟C迟

需要，看下CNS上相关的研究文章你就知道了。

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