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科研学霸天团，48小时有问必答

问酶切目的基因及质粒载体后加Loading buffer终止反应,然后要直接进行连接反应,可以吗?要是不行,还有一种方法就是加热灭

bamboopiggy

酶切目的基因及质粒载体后加Loading buffer终止反应,不能直接进行连接反应，需要跑胶进行胶回收后，再进行连接反应。不建议用加热灭活限制酶的方法，因为酶切后跑胶，1是可以鉴定酶切产物对不对，2是可以进行纯化，去掉酶切带来的盐，有利于进行下一步的连接。

3 回答6099 围观

问PCR扩增到特异性产物后，回收PCR产物，PCR产物用BamHI和EcoRI（NEB公司的酶）在随EcoRI的BUFFER中双酶

bamboopiggy

蓝斑说明没有连接成功，NEB公司的酶，不需要酶切那么长的时间，并且酶切后，你跑胶鉴定了么？如果有条带，再进行胶回收和连接。一般QIAGEN quick spin column的柱子出问题的可能性不大，最大的可能就是你酶切完，没有跑胶鉴定。

3 回答867 围观

问基因扩增时候以cDNA为模板，为何扩增出一片弥散的带？

dxywode

我也是用cDNA做模板的，没有出现过弥散带的情况，但经常出现非特异性条带。出现弥散带的原因可能是你在做凝胶电泳时电泳液被污染或者是做的胶有问题，也可能是你的cDNA部分降解了，至于降解的原因主要是由于时间和温度。扩增完的东西要立即进行电泳，其次电泳的室温不宜太高时间不要太长，一般最多半个小时左右。另外在扩增过程中，由于气候的缘故，部分PCR仪在室温超过30度后就不能正常工作了，这要看PCR仪的型号

4 回答4885 围观

问吲哚美辛腹腔注射试剂怎么制备

dxywode

本试验处方中以二甲基甲酰胺和注射用水作为混合溶媒，提高吲哚美辛的溶解度，乙醇胺调节PH值，进一步增大吲哚美辛溶解度，乳酸调节pH值减少刺激性。吲哚美辛易溶于二甲基甲酰胺，但当加入等体积注射用水后吲哚美辛易析出。此外pH值的变化也能影响吲哚美辛的溶解。因此本处方中的影响因素主要有吲哚美辛的投药量，二甲基甲酰胺用量，乙醇胺用量及pH值的大小，根据主要影响因素设计如下的三个处方，通过观察是否有药物析出以

3 回答870 围观

问感染细胞不同时间点收样，怎么确定什么时候收样？

dxywode

转染的质粒和promoter不同，细胞表达的时间也不尽相同。一般在24-48小时之间。你第一次做的话，就勤快点常观察。

3 回答2650 围观

问求教！小鼠丘脑定向注射给药如何不容易反流？

天一湖医者

小鼠丘脑定向注射给药具体方法及步骤，希望可以帮到你。

2 回答578 围观

问请问形成包涵体的融合蛋白，能使用包涵体裂解液之后，用Glutathione Sepharose 4B亲和层析吗？

天一湖医者

使用包涵体裂解液之后，最好选择Glutathione Sepharose这样载量更高,流速更快.

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问请问大家常用于亚细胞定位做内质网标记都有哪些？

bamboopiggy

ER-Tracker™ Green (BODIPY® FL Glibenclamide)，或者用ERp72 ，PDI 抗体都可以

2 回答946 围观

问请问多高浓度的SDS,Triton100,NP40可以导致细胞核破裂？

bamboopiggy

不建议用sds，因为里离子型去垢剂，裂解强度比较大，一般建议用triton100 ，或np40。NP40 0.0.5% 作用5min，可以裂解掉细胞膜。

3 回答5260 围观

问放线菌中色素的分离大概需要多少色素提取物

天一湖医者

色素0.15g溶于50ml水中就可以。

1 回答392 围观

问干细胞在培养瓶里一般4小时左右可以贴璧，8小时完全铺展，做迁移测试时放多长时间合适呢？

天一湖医者

一般认为24h为细胞的一个周期，在选取合适的时间点(6，12，24h)检测划痕宽度时，最好不要超过细胞一个周期的时间;③ 如果要单纯考虑细胞迁移，可以先用丝裂霉素(1μg/ml)处理1h，抑制细胞的分裂。

3 回答1813 围观

问干细胞CFU计数问题

bamboopiggy

造血干细胞的集落形成检测：1)将所需要的MethoCult®培养基在2-8℃过夜或室温融化。(2)用16 号钝针头的注射器将培养基分装于流式管中（3.3ml/管）(3)准备三个35 mm的培养皿，制备双份培养系统。具体方法如下：把两个35mm的带盖培养皿和一个盛有水的35mm无盖培养皿一起放置到100 mm的培养皿中。(4)准备CD34 细胞，细胞计数仪计数后用0.3mlIMDM 2%FBS稀释细

2 回答915 围观

问细胞摄取实验是不是只有在做载抗癌药物时才需要做的呢？若所做的不针对癌细胞，是否可以不做细胞摄取实验呢?

bamboopiggy

这个取决于你要说明什么问题吧？如果你要说明你细胞基因的改变，会影响某种物质的摄取，你当然要做摄取实验啊。

1 回答464 围观

问siRNA导入细胞有哪些方法，哪种最好？

bamboopiggy

1取决于你的实验目的，细胞还是动物2.要看你要导入的是什么细胞？贴壁细胞一般，用化学转染，悬浮细胞用电转的多。生殖细胞用显微注射，动物可以用载体导入。

3 回答537 围观

问同种组织的两种细胞直接共培养

bamboopiggy

贴壁细胞一般用DMEM高糖，悬浮细胞一般用1640，两种细胞直接共培养的培养基可用DMEM高糖，因为DMEM高糖的营养成分比1640多。培养两种细胞的比例需要你做预实验确定，一般从1：1开始，当然你可以评估一下它们在组织中的分布比例。

3 回答1560 围观

问想用荧光显微镜观察病毒感染细胞后的形态，是用普通光学显微镜还是需要荧光显微镜

bamboopiggy

这个要看你的病毒带不带荧光，，如果带荧光，可以用荧光显微镜，顺便还可以看一下转染效率

2 回答3276 围观

问病毒以MOI为1接种细胞，是不是需要提前测TCID50后再计算病毒接种体积

bamboopiggy

MOI是multiplicity of infection的缩写，中文译为感染复数，一般认为MOI是一个比值，没有单位，其隐含的意思是 pfu number/cell,即病毒颗粒数/细胞数。如果你的pfu/ml值为undefined109（9次方），那么1毫升病毒液中有10的9次方个病毒颗粒。如果你知道病毒滴度（pfu/ml）的值，那就简单些啦（因为病毒滴度（pfu/ml）的值得出是比较麻烦的），MOI=（p

2 回答3736 围观

问培养贴壁细胞，例如小肠上皮细胞用胰蛋白酶消化的时间，如何判断？

bamboopiggy

加入胰酶后，润湿一下细胞，然后吸出胰酶，不用吸的太干净。然后镜下观察，细胞变圆了，就可以终止胰酶消化了，容易消化的细胞大概30s-1min，不容易消化的，可以放37度数分钟，主要镜下观察形态改变

2 回答1369 围观

问培养的原代卵巢颗粒细胞支原体污染如何判断？

bamboopiggy

400X看不到支原体的，检测支原体最简单的方法就是取培养液，直接进行pcr检测。

2 回答317 围观

问如何制作简易的小鼠代谢笼

天一湖医者

这个比较详细，参考一下http://www.xjishu.com/zhuanli/01/201821722968.html

1 回答1244 围观

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