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科研学霸天团,48小时有问必答
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DNA琼脂糖凝胶电泳
dxywode
电泳时间可能过长,一般75v×30min左右,但是具体看溴酚蓝得离孔距离和目的条带离孔距离。利用电泳可以确定胶体微粒的电性质,向阳极移动的胶粒带负电荷,向阴极移动的胶粒带正电荷。金属氢氧化物、金属氧化物等胶体微粒吸附阳离子,带正电荷;非金属氧化物、非金属硫化物等胶体微粒吸附阴离子,带负电荷。
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问
巨噬细胞造泡沫细胞模型?
天一湖医者
是不是细胞已经处于发炎状态了?
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问
直扩型核酸检测,不用核酸提取步骤,这么方便的话,为什么没有大批量的替代传统的柱式法/磁珠法DNA提取?有什么弊端呢?
bamboopiggy
1.直扩适用于哪些DNA样品?2.直扩时间短、效率高,为什么没有在这次新冠检测上大批量铺开?3.直扩和传统DNA提取有什么区别和优劣 其实直扩型相当于是菌落pcr,dna的得率和纯度不够。结果假阴性假阳性都可能出现。你也就知道为什么没有大面积铺开了。 直扩型适用于genotyping等样本量多,只需鉴定有或无,大或小的实验。传统dna提取,适用于pcr产物回收,进行连接,转化的。
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问
柱式法核酸提取和磁珠法核酸提取原理都差不多,只是固定项不一样,那么二者的裂解、结合清洗一套试剂是否可以互换通用?
bamboopiggy
原理是一样,但是不建议你互换或者是混合使用试剂,因为公司给的试剂,都是配套的采取了最优化的PH和盐浓度。并且硅胶柱法核酸的回收效率高、纯度好,而磁珠法适合于低浓度核酸的提取,只是通量大。你二者混用也没啥意思啊。
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问
Frank-starling机制在大鼠心肌上验证
bamboopiggy
这不就是生理上的异长调节么?Frank当时是在离体的蛙心上做的,你可以考虑做离体的大鼠心脏,然后改变灌流液中钙离子的浓度,来进行检测。
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问
在设计RCA环状模板时,模板长度在什么范围内合适
bamboopiggy
RCA的模板,不是取决于你实验的目的么?如果用phi29 DNA聚合酶可连续合成长达70kb的DNA片段。
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问
转染质粒做基因敲入,效率太低,怎么提高?
bamboopiggy
cripsr cas9的质粒是比较大的,不建议用lipo2000转,建议用电转,效率高。
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问
酶切目的基因及质粒载体后加Loading buffer终止反应,然后要直接进行连接反应,可以吗?要是不行,还有一种方法就是加热灭
bamboopiggy
酶切目的基因及质粒载体后加Loading buffer终止反应,不能直接进行连接反应,需要跑胶进行胶回收后,再进行连接反应。不建议用加热灭活限制酶的方法,因为酶切后跑胶,1是可以鉴定酶切产物对不对,2是可以进行纯化,去掉酶切带来的盐,有利于进行下一步的连接。
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问
PCR扩增到特异性产物后,回收PCR产物,PCR产物用BamHI和EcoRI(NEB公司的酶)在随EcoRI的BUFFER中双酶
bamboopiggy
蓝斑说明没有连接成功,NEB公司的酶,不需要酶切那么长的时间,并且酶切后,你跑胶鉴定了么?如果有条带,再进行胶回收和连接。一般QIAGEN quick spin column的柱子出问题的可能性不大,最大的可能就是你酶切完,没有跑胶鉴定。
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问
基因扩增时候以cDNA为模板,为何扩增出一片弥散的带?
dxywode
我也是用cDNA做模板的,没有出现过弥散带的情况,但经常出现非特异性条带。出现弥散带的原因可能是你在做凝胶电泳时电泳液被污染或者是做的胶有问题,也可能是你的cDNA部分降解了,至于降解的原因主要是由于时间和温度。扩增完的东西要立即进行电泳,其次电泳的室温不宜太高时间不要太长,一般最多半个小时左右。另外在扩增过程中,由于气候的缘故,部分PCR仪在室温超过30度后就不能正常工作了,这要看PCR仪的型号
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问
吲哚美辛腹腔注射试剂怎么制备
dxywode
本试验处方中以二甲基甲酰胺和注射用水作为混合溶媒,提高吲哚美辛的溶解度,乙醇胺调节PH值,进一步增大吲哚美辛溶解度,乳酸调节pH值减少刺激性。吲哚美辛易溶于二甲基甲酰胺,但当加入等体积注射用水后吲哚美辛易析出。此外pH值的变化也能影响吲哚美辛的溶解。因此本处方中的影响因素主要有吲哚美辛的投药量,二甲基甲酰胺用量,乙醇胺用量及pH值的大小,根据主要影响因素设计如下的三个处方,通过观察是否有药物析出以
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问
感染细胞不同时间点收样,怎么确定什么时候收样?
dxywode
转染的质粒和promoter不同,细胞表达的时间也不尽相同。 一般在24-48小时之间。你第一次做的话,就勤快点常观察。
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问
求教!小鼠丘脑定向注射给药如何不容易反流?
天一湖医者
小鼠丘脑定向注射给药具体方法及步骤,希望可以帮到你。
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问
请问形成包涵体的融合蛋白,能使用包涵体裂解液之后,用Glutathione Sepharose 4B亲和层析吗?
天一湖医者
使用包涵体裂解液之后,最好选择Glutathione Sepharose这样载量更高,流速更快.
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请问大家常用于亚细胞定位做内质网标记都有哪些?
bamboopiggy
ER-Tracker™ Green (BODIPY® FL Glibenclamide),或者用ERp72 ,PDI 抗体都可以
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问
请问多高浓度的SDS,Triton100,NP40可以导致细胞核破裂?
bamboopiggy
不建议用sds,因为里离子型去垢剂,裂解强度比较大,一般建议用triton100 ,或np40。NP40 0.0.5% 作用5min,可以裂解掉细胞膜。
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问
放线菌中色素的分离大概需要多少色素提取物
天一湖医者
色素0.15g溶于50ml水中就可以。
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问
干细胞在培养瓶里一般4小时左右可以贴璧,8小时完全铺展,做迁移测试时放多长时间合适呢?
天一湖医者
一般认为24h为细胞的一个周期,在选取合适的时间点(6,12,24h)检测划痕宽度时,最好不要超过细胞一个周期的时间;③ 如果要单纯考虑细胞迁移,可以先用丝裂霉素(1μg/ml)处理1h,抑制细胞的分裂。
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问
干细胞CFU计数问题
bamboopiggy
造血干细胞的集落形成检测:1)将所需要的MethoCult®培养基在2-8℃过夜或室温融化。(2)用16 号钝针头的注射器将培养基分装于流式管中(3.3ml/管)(3)准备三个35 mm的培养皿,制备双份培养系统。具体方法如下:把两个35mm的带盖培养皿和一个盛有水的35mm无盖培养皿一起放置到100 mm的培养皿中。(4)准备CD34 细胞,细胞计数仪计数后用0.3mlIMDM 2%FBS稀释细
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问
细胞摄取实验是不是只有在做载抗癌药物时才需要做的呢?若所做的不针对癌细胞,是否可以不做细胞摄取实验呢?
bamboopiggy
这个取决于你要说明什么问题吧?如果你要说明你细胞基因的改变,会影响某种物质的摄取,你当然要做摄取实验啊。
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