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利用RACE ，可以很简单地得到mRNA的5＇末端序列，然而5＇RACE是一个很复杂的技术，它的成功依赖每一步反应的有效完成（图1）。cDNA第一链的合成是由一个反义的基因特异性引物（Gene－specific primer，GSP）来起始的，cDNA第一链纯化后，利用末端脱氧核苷酸转移酶（Terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT）在cDNA的 ...

第一节 概 述 从真核生物的组织或细胞中提取mRNA，通过酶促反应逆转录合成cDNA的第一链和第二链，将双链cDNA和载体连接，然后转化扩增， 即可获得cDNA文库，构建的cDNA文库可用于真核生物基因的结构、表达和调控的分析;比较cDNA和相应基因组DNA序列差异可确定内含子存在和了解转录后加工等一系列问题。总之cDNA的合成和克隆已成为当今真核分子生物学的基本手段。自70年代中叶首例cDNA克 ...

RNA沉默是广泛存在于生物中的一种古老现象，是生物抵抗异常DNA的一种保护机制同时在生物生长发育过程中扮演着基因表达调控的角色。文章对RNA沉默研究中的几个热点问题进行了介绍，按RNA沉默持续时间的不同对其在植物中应用的方法进行了分析，并重点论述了RNA沉默在植物功能基因组研究、作物品质改良以及抗病毒植物培育等方面的应用及其发展前景。 RNA沉默(RNAsilencing)是一种结合和降解特异mR ...

1. 对每个基因设计并检测两到四个siRNA 序列 为了找到潜在靶位点，扫描靶基因中的AA序列。记录每个AA 3’端19个核苷酸作为潜在siRNA 靶位点。潜在靶位点需通过GENBANK数据库的BLAST分析，去除那些与其它基因明显同源的靶位点。如果可能，siRNA 应根据mRNA 低二级结构的区域设计。美国著名RNA 产品公司Ambion提供网上在线设计工具，帮助您更快地完成这项工作 ...

在活体RNAi关键点：类似药物属性的引入，如稳定性、细胞内的传送、组织的生物可溶性进入合成的siRNA。

【原理】 RNA的制备与分析对于了解基因表达在转录水平上的调节是必不可少的，也是最常使用的通过cDNA途径分析细胞基因表达的前提。通常一个典型的哺乳动物细胞约含10-5μg RNA，但其中大部分为rRNA及由tRNA，而mRNA仅占1%～5%。虽然mRNA大小和序列各不相同，但在多数真核细胞mRNA的3’末端都带有一段较长的多腺苷酸链。这个群体编码了所有由该细胞合成的多肽。RN ...

第一节 概 述 从真核生物的组织或细胞中提取mRNA ，通过酶促反应逆转录合成cDNA的第一链和第二链，将双链cDNA和载体连接，然后转化扩增， 即可获得cDNA文库，构建的cDNA文库可用于真核生物基因的结构、表达和调控的分析;比较cDNA和相应基因组DNA序列差异可确定内含子存在和了解转录后加工等一系列问题。总之cDNA的合成和克隆已成为当今真核分子生物学的基本手段。自70年代中 ...

RNA 一度被认为仅仅是DNA和蛋白质之间的“过渡”，但越来越多的证据清楚的表明，RNA 在生命的进程中扮演的角色远比RNA 我们早前设想的更为重要。RNA 干扰（RNA interference）的发现使得人们对RNA 调控基因表达的功能有了全新的认识，更因为可以简化替代基因敲除而成为研究基因功能的有力工具，因此格外引人注意，在2002年度Science评选的10大科学成 ...

实验目的 从黄化小麦苗中提取总RNA ，可以为cDNA 文库的构建做好准备。我们重点是要保证RNA 的完整性、产率、防止修饰和纯度，尤其是完整性、防止修饰和纯度。RNA 是单链，2’OH是它的化学性质远比DNA 活泼。所以，提取RNA 颇为不易。加之RNA 的不均一性，要将所有的RNA （rRNA 、tRNA 、mRNA ）完全提出，更加有挑战性。而Rnase是无处不在的（这种酶遇高 ...

真核细胞的mRNA分子最显著的结构特征是具有5’端帽子结构（m7 G）和3’端的Poly(A)尾巴。绝大多数哺乳类动物细胞mRNA的3’端存在20-30个腺苷酸组成的Poly（A）尾，通常用Poly（A+ ）表示。这种结构为真核mRNA的提取，提供了极为方便的选择性标志，寡聚（dT）纤维素或寡聚（U）琼脂糖亲合层析分离纯化mRNA的理论基础就在于此。 mRNA的 ...

RNA 酶污染是全体从事 RNA 相关实验的人员的头号公敌。即使是100度高温或者是高压灭菌也不能完全灭活无孔不入的 RNases 。因而相关的实验中往往要用到RNA 酶抑制剂。最常用的 RNA 酶抑制剂 Human Placental ribonuclease inhibitor （ HPRI ）是一种蛋白质，可与多种 RNA 酶（包括 RNases A B C 类）非共价结合成为等摩尔复合物， ...

小分子干扰RNA (Small interfering RNA ，siRNA ) 是一种非常有效的工具，能够在包括哺乳动物细胞在内的多个体系中抑制特定基因的表达，从而研究某个基因的功能或者是相关信息。但是这种强有力的方法的难题之一是需要设计，合成siRNA s 和验证其效果，从而找到最有效的siRNA s 。这个过程需要花费相当的时间和经费。以化学法合成基因特异的siRNA s 为例，由于设计好的 ...

大约在十年前，2006年诺贝尔生理/医学奖得主CraigMello和AndrewFire发现，他们能够将短RNA 分子插入到线虫中并沉默特定基因的表达。今天，研究人员也常常使用这种强大的RNA 干扰方法来研究哺乳动物系统中的特定基因功能。 为了进行这种基因沉默实验，研究人员通常需要依赖化学合成的RNA 分子，而这个合成过程是相当昂贵的。本月《冷泉港实验手册》（ColdSpringHarborPro ...

Here is our T7 siRNA protocol. The main idea is to design primers that begin with GG so that transcription by T7 polymerase is efficient. I) FIRST design oligos: Using sense coding sequence of any gen ...

Helvetica sans-serif" size="-1"Our current strategy with siRNA is to synthesis relatively small amounts enzymatically and use these to test for efficiency by western blotting. This allows us to test ...

We routinely produce dsRNA by in vitro transcription of a PCR generated DNA template containing the T7 promoter sequence on both ends (I. Primer Designed dsRNA). It is also possible to produce dsRNA u ...

Prior to Extractions ・ Bake all necessary glassware metal spatulas mortars and pestles overnight in a 200°C oven after wrapping them in aluminum foil. For each sample you should minima ...

AMES/Chloroform extraction in our lab to extract total from potato leaves for viroid analysis. The protocol is as follows: AMES Buffer (for 200mL): 11.7g NaCl 160 mL dH2O &nbs ...

Restriction Map and Cloning Site of the RNAi-Ready pSIREN-DNR Vector. Unique restriction sites are in bold. RNAi-Ready pSIREN-DNR is pr ...

3' Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE) PCR This technique is used to obtain the 3'end of a cDNA it requires some sequence information internal to the mRNA under study. The sequence information obt ...