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原创：Chromatography weixingui@263.net， 推荐书籍：《蛋白纯化与实验鉴定指南》、《生物工程下游技术》、《酶工程》、《酶制剂工业》 1）我现在手头有个融合蛋白，纯化的时候用助溶剂溶解后做了GST亲和层析，之后用蛋白酶切割后却发现目的蛋白没有活性。 请问有哪些可能会出现这种原因？怎么解决？测过基因序列，没有问题。细胞破碎后，融合蛋白在沉淀里，我用助溶剂提取后，可以用GS ...

微生物传统的鉴定方法是建立在微生物的形态学、生态学、细胞生理和生化以及基因的基础上的，自20世纪80～90年代以来，微生物鉴定系统不断发展，自动化程度不断提高，但也是建立在传统的生理生化和基因基础上。无论是微生物鉴定的传统技术还是基于传统的生理生化和基因基础上的自动化仪器技术，它们均需要经过培养繁殖、分离纯化等步骤，然后再根据表型和基因型来进行鉴定，但是由于微生物群落及其生存环境的复杂性，目前自然 ...

二级结构是指多肽链借助于氢键沿一维方向排列成具有周期性的结构的构象，是多肽链局部的空间结构（构象），主要有α－螺旋、β－折叠、β－转角等几种形式，它们是构成蛋白质高级结构的基本要素。 α－螺旋(α－helix)是蛋白质中最常见最典型含量最丰富的二级结构元件.在α螺旋中，每 个螺旋周期包含 3.6 个氨基酸残基，残基侧链伸向外侧，同 ...

Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术: 一、原理 二、分类 i.放射自显影 ii.底物化学发光ECL iii.底物荧光ECF iv.底物DAB呈色 三、主要试剂 四、主要步骤 五、 ...

第一章 绪 论 1．蛋白质组： 一个基因组内所有基因表达的全部蛋白质。的定义有什么不足。 蛋白质组：不同类型的细胞或同一个细胞在不同的活动，状态（时空）下，蛋白质组的蛋白质种类构成却很不一样。因此，蛋白质组的定义：一个基因组内所有基因表达的全部蛋白质。定义从字面上容易理解，但在实际中却很成问题。 2．如何理解从基因组－蛋白质组是一个复杂而漫长的里程。 ①目前基因注释的方法还有较高的出错率，尤其对那 ...

1）大量养晶法（bulk crystallization）：若急着养出单晶，则将纯化之蛋白质溶液加入固体盐类或饱和盐液，直到溶液中出现乳白混浊色，离心后把上清液（suppernatant）放置数天至数周，有可能养出单晶。 （2）批次养晶法（batch method）:若发现加入蛋白质的沉淀剂和盐类等化学药品，在浓度c1产生沉淀，浓度cn为液体，则在c1至cn之间细分成一串浓度c1>c2> ...

真核生物细胞状态是由内源和外源因素共同影响的，所有信号传递途径的终点都是DNA 。DNA 通过核蛋白复合物组成染色质，染色质是基因调控的一个重要作用位点。转录激活因子和辅助抑制因子的研究显示存在一种新的调节机制--" 组蛋白密码" ，其信息存在于组蛋白的转录后修饰等过程中。该类修饰包括组蛋白磷酸化、乙酰化、甲基化、ADP- 核糖基化等过程。随着越来越多组蛋白核心结构区域和羧端修 ...

新颖的去污剂混合物 即时可用的ZOOM® 2D Protein Solubilizers是1.1X溶液由溶解在去离子、0.2微米过滤的7.7M尿素(urea)和2.2M硫脲(thiourea)中的特有的去污剂混合物组成。 通过这些混合物你将: 节省时间以及消除制备错误--无需称量混合固体试剂和离液剂去离子。 获得可重复结果-ZOOM® 2D Protein Solubilizers ...

一、材料与仪器 30%丙烯酰胺溶液；1.5mol/L Tris-HCl分离胶缓冲液，pH8.8；1.0mol/L Tris-HCl浓缩胶缓冲液，pH6.8；电泳缓冲液，pH8.3；10%SDS溶液；10%过硫酸铵溶液；样品处理液；染色液；脱色液；电泳玻璃板，电泳电源架，电泳槽，电泳仪等；蛋白Mark。 二、方法与步骤 1)分离胶和浓缩胶配制 按下表比例分别配制分离胶和浓缩胶： 表2-7：聚丙烯酰胺 ...

目前构建重组腺病毒系统的策略，主要有三种 1)体外直接连接(clontech的ADENO-X系统) 2)在细菌中重组的策略(adeasy系统) 3)在293细胞中重组的策略（AdMax系统） 国家人类基因组北方研究中心通过与美国Vector Biolab公司合作开发出了一套不同于以上策略的新的重组腺病毒系统。通过这套系统，实现了重组腺病毒载体构建，包装的高通量化。在不到一年的时间里，成 ...

人体内真正发挥作用的是蛋白质，蛋白质扮演着构筑生命大厦的“砖块”角色，随着破译生命密码的人类基因组 计划进入尾声，一个以蛋白质和药物基因学为研究重点的后基因组 时代已经拉开序幕，蛋白质将是今后的重点研究方向之一。然而，蛋白质的分离和鉴定非常费时，目前测定蛋白质的技术远远落后于破译基因组 的工具，最好的实验室每天只能分离和识别出100种蛋白质。据估计，人体内可能有几十万种蛋白 ...

国外的同学说一般他们克隆都是直接购买感受态细胞转化，实验效率很高的。我总是以为如果是一般的克隆实验，自己做感受态好像够用了－－如果是建库，购买现成的感受态细胞就是非常必要的首选，因为转化效率确实比实际手工制备的高2－3个数量级以上，特别是建库，能实实在在地提高实验的效率。实际上，除了建库以外，Stratagene为更好的表达蛋白、以及转化效率较低的巨无霸质粒，而特别优化了一些感受态细胞，做表达的人 ...

在基因表达研究中，研究者比较注意选择合适的表达载体和宿主系统，而往往忽视基因本身是否与载体和宿主系统为最佳匹配这样一个实质性问题。基因的最佳化表达可以通过对基因的重新设计和合成来实现，如消除稀有密码子而利用最佳化密码子，二级结构最小化，调整GC含量等。以下就密码子最佳化、翻译终止效率和真核细胞中异源蛋白表达的问题加以说明。 密码子最佳化（codon optimization） 遗传密码有64种，但 ...

结构域是在二级结构或超二级结构的基础上形成三级结构的局部折叠区，一条多肽链在这个域范围内来回折叠，但相邻的域常被一个或两个多肽片段连结。通常由50-300个氨基酸残基组成，其特点是在三维空间可以明显区分和相对独立，并且具有一定的生物功能如结合小分子。模体或基序（motif）是结构域的亚单位，通常由2～3二级结构单位组成，一般为α螺旋、β折叠和环（loop）。 对那些较小的球 ...

一、植物组织蛋白质提取方法 1、根据样品重量（1g样品加入3.5ml提取液，可根据材料不同适当加入），准备提取液放在冰上。 2、把样品放在研钵中用液氮研磨，研磨后加入提取液中在冰上静置（3-4小时）。 3、用离心机离心8000rpm40min4℃或11100rpm20min4℃ 4、提取上清液，样品制备完成。 蛋白质提取液：300ml 1、1Mtris-HCl（pH8）45ml 2、甘油（Gly ...

The human and bovine 14-3-3 eta protein mRNAs are highly conserved Evolutionary conservation of the 14-3-3 protein Expression and structural analysis of 14-3-3 proteins Crystal structure of the zeta i ...

Purification of GST fusion proteins in E.coli GST Sugden labMcArdle Laboratory for Cancer ResearchUniversity of Wisconsin-Madison Medical School Screen of GST-Fusion Protein Expression (pGEX system by ...

Research Tools: Synthetic Biology and Protein Engineering Research Goals: (1)Improve the performance the key proteinssuch as turn-over numberKmsubstrate promiscuitythermostabilityinhibitionetc.by prot ...

9M Urea2.5mM EDTA2.5mM EGTA1% DTE4% CHAPS make 10ml and aliquot 10x1mlfreeze at -70℃ Lysate preparation wash the cells 2x with PBS wash the cells 1x with 10mM Tris250mM Sucrose lyse the cells with 100 ...

References: Watterson et al.(1980)J Biol Chem 255:962-75. Charbonneau et al.(1979)Biochem Biophys Res Commun 90:1039-47. Extraction of Calmodulin Solutions: 1.1 N NH4OH stored at room temperature. 2.1 ...