以下每一个试剂盒都有实验步骤，操作说明及结果图片等，3年反复实验的成果。因JPG, GIF, PNG 图片过大，不能上传，如有需要请发邮箱dushengbiotech@163.com，说明需求，即有回复，欢迎技术讨论及咨询。1、Nova Taq DNA Polymerase（聚合酶）2、Nova Pfu DNA Polymerase3、Nova Kod DNA Polymerase4、Nova Extra-Kod DNA Polymerase5、Nova Tth DNA Polymera ...
一、细胞裂解的准备(1)1×107 细胞重悬, 其来源可为新鲜样品或贮存于- 80℃ 1mo l 冰冻清洗缓冲液中的无DM SO 的样品, 冰冻缓冲液包括10mM HEPES (pH7. 5), 1. 5mM M gCl2, 10mM KCl,1mM 二硫苏糖醇(DTT ) , 然后离心(16 000rpm、4℃、1m in)。(2)重悬细胞团于100ul 冰冻裂解缓冲液, 其包含10mM T ris-HCl (pH7. 5) , 1mM MgCl2, 1mM EGTA , 0. 1mM 苯甲基磺酰氟(DMSF ) , 5mM B2巯基乙醇, 0. 5% CHA P s(Pierce) 和10% 甘油。(3)冰育30 分, 然后在超速离心机 ...
RT-PCR实验有三步：抽提RNA，RT，PCR。要求：1.做RT前必需测RNA浓度，逆转录体系对RNA量还是有一些要求，常用500ng或1ug。2. RT按要求做，一般不会出太大问题。3. PCR，按常规。但如需扩长片段，则对前两步要求较高，需要有完整的cDNA存在，不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。1）RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列？必须在RT时，引物设计有3种方法即a：Random 9mers；b ...
差异基因表达的研究受到了广泛的关注，常用的技术有DD-PCR；GENE-FISHING；GENECHIP等。简单介绍如下：DDRT—PCR技术即mRNA差异显示聚合酶链式反应技术，此技术是以PCR技术和聚丙烯凝胶电泳技术为基础，结合银染或放射性自显影等显色技术，能快速有效地鉴定并克隆两个或多个平行材料之间的差异表达基因。DDRT—PCR技术的基本过程如下：①提取两组平行材料中的总RNA或mRNA；②在逆转录酶作用下 ...
近四个月来，我关于肿瘤系列实验设计方案的演变历程2003年9月25日，我完成了第一个实验设计方案“我的实验设计”，共有5个实验，是用化学致癌物做大鼠肝癌模型，实验的核心就是做支配肝脏自主神经的电生理参数测定，看看自主神经放电强度和正常对照组相比是否出现了显著性降低；如果实验组自主神经放电强度和正常对照组相比出现了显著性降低，那么，再比较自主神经放电强度降低出现时间和大鼠产生肝癌时间的先后，以明确因果关系。此前， ...
大肠杆菌克隆转化作为分子生物学的基础之一，具有广泛的应用性。并且，随着新技术的发展，大肠杆菌克隆转化操作变得比以前更加简单易行。下面，我将以结合自己研究生对于这个体系操作的经验，对于现行的大肠杆菌操作体系进行一定的优化，希望能够给大家节省克隆转化的时间以及提高成功率。一般来说，克隆转化从开始到结束分为获取基因，设计引物，PCR基因，酶切，连接，转化，菌落PCR以及挑取克隆酶切验证几个步骤。下面我将根据时间顺序，对每 ...
有关甲基化引物的帖子版内已经很多了，但是同一种基因有多种引物，各引物的反应条件又多有差别，开此帖的目的一半是为了私心，想让大家帮我看看结果，出出主意，另外也是为了增进大家的交流，减少像我这种新手在摸索过程中所走的弯路。先抛砖引玉一下，自己最近做p16.PTEN和MGMT三种基因的MSP：p16甲基化引物上游为5′- TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC -3′，下游为5′- GACCCCGAACCGCGACCGT ...
PCR常见问题总汇 PCR产物的电泳检测时间 一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。假阴性，不出现扩增条带 PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模 板核酸变性不彻底。 ...
测序结果常见的几个问题 1 、 为什么开始一段序列的信号很杂乱，几乎难以辨别?这主要是因为残存的染料单体造成的干扰峰所致，该干扰峰和正常序列峰重叠在一起；另外，测序电泳开始阶段电压有一个稳定期，所以经常有20-50 bp 的紧接着引物的片段读不清楚，有时甚至更长。2 、 为什么在序列的末端容易产生 N 值，峰图较杂?由于测序反应的信号是逐渐减弱的，所以序列末端的信号会很弱，峰图自然就会杂乱，加上测序胶的分辨率问题，如果碱基分不开，就会产生 N 值，正常情况 ...
PCR产物的电泳检测时间 一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。假阴性，不出现扩增条带 PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq 敢种 剂，③模板中蛋白质?有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时， ...
扩增长目的片段当扩增大于5kb的目的片段时，可以使用用于超长PCR的酶或酶混合物以获得最佳产量（图24）。Taq DNA聚合酶并不能有效扩增较长目的片段（大于5kb），可能是因为其缺少3'-5'外切核酸酶活性，不能纠正dNTP错误掺入。错误配对的延伸几率大大降低，减少了较长产物的产量。将Taq DNA聚合酶同带有3'-5'外切核酸酶活性的热稳定DNA聚合酶混合，可以扩增最高为30kb的目的片段。Platunum Pfx DNA聚合酶 ...
影响PCR的主要因素PCR技术必须有人工合成的合理引物和提取的样品DNA，然后才进行自动热循环，最后进行产物鉴定与分析。引物设计与合成目前只能在少数技术力量较强的研究院、所进行，临床应用只需购买PCR检测试剂盒就可开展工作，PCR自动热循环中影响因素很多，对不同的DNA样品，PCR反应中各种成份加入量和温度循环参数均不一致。现将几种主要影响因素介绍如下。 一、温度循环参数 在PCR自动热循环中，最关键的因素是变性与退 ...
增加PCR的特异性：1. primers design这是最重要的一步。理想的，只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的 一些条件a. 足够长,18-24bp,以保证特异性.当然不是说越长越好,太长的引物同样会降低特异性,并且降低产量b. GC% 40%~~~~60% c. 5'端和中间序列要多GC,以增加稳定性d. 避免3'端GC rich, 最后3个BASE不要有GC,或者最后5个有3个不要是GCe. 避免3'端的互补, 否则容易造成DIMER f. 避免3'端 ...
PCR基础分子生物学技术正以惊人的速度发展，特别是近20年来已经成为生命科学的一个主要的生长点。1976年cDNA克隆技术的建立，使分子生物学更加迅速广泛地渗透到医学各学科，发展了各学科的分子理论基础。1985年Mullis首先描述的多聚酶链反应（ PCR， Polymerase Chain Reaction ），使一向昂贵、繁杂、严格的分子生物学试验能够在比较简易、经济的条件下有效的开展，是基因分析技术的一项重大突破。这一技术 ...
问题可能原因建议解决方法定量PCR 无扩增产量或很少的扩增产量DNA模板质量不好，含有抑制剂提高模板质量，诸如DMSO，SDS和甲酰胺之类的试剂会抑制Taq DNA聚合酶。如果怀疑污染了抑制剂，可以使用乙醇沉淀DNAPCR引物设计较差避免在引物3'端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。探针设计较差对探针序列进行blast比对，设计符合要求的探针PCR引物合成较差用普通电泳法，看引物的设 ...
使用Exicycler 96发表的文章Ref.#Reference1Dissection of the essential steps for condensin accumulation at kinetochores and rDNAs during fission yeast mitosisNorihiko Nakazawa, Takahiro Nakamura, Aya Kokubu, Masahiro Ebe, Koji Nagao and Mitsuhoro Yanagida.J Cell Biol. 2008 Mar 2 ...
我的课题涉及到CYP1A1的多态，从文献上（cancer res等级别的文章，而且重复的人挺多）查到它的一个MspI多态位点引物为5’-CAG TGA AGA GGT GTA GCC GCT-3＇和5’-TAG GAG TCT TGT CTC ATG CCT-3’，但我有扩增出了其他引物的条件都没有能扩增出这对引物的目标带，做梯度从48到65度都没有带出来。下面是所查的该引物的Blast的资料和该基因这个位点的基因序列资料，请高手帮忙分析一下到底这对引物可不可以扩 ...
Primer designThe gene of interest usually has to be amplified from genomic or vector DNA by PCR (polymerase chain reaction) before it can be cloned into an expression vector. The first step is the design of the necessary primers.Important features are:Primer sequence. Especially the 3'-end of t ...
PCR问题及解决内容：Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 292Developing a PCR Strategy: The Project Stage . . . . . . . . . . . . . 293Assess Your Needs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 293Identify Any Weak Links in Your PCR Strategy . . . . . . . . . . 295Manipulate the Reaction to Meet Your Needs . . . . . . . . . . 296Developing a PCR Strategy: The Experimental Stage . . . . . . . 296What Are the Practical Cr
拟扩增408位至3533位，插入真核表达载体pCAGGS扩增，请高手帮忙设计引物，指点一下不胜感激！1 agaagtttat ctgtgtgaac ttcttggctt agtatcgttg agaagaatcg agagattagt61 gcagtttaaa cagtttttta gaacggaaga taaccatgac taaaaaacca ggagggcccg121 gtaaaaaccg ggctatcaat atgctgaaac gcggcctacc ccg ...
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