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PCR需要注意的一些问题

扩增长目的片段当扩增大于5kb的目的片段时,可以使用用于超长PCR的酶或酶混合物以获得最佳产量(图24)。Taq DNA聚合酶并不能有效扩增较长目的片段(大于5kb),可能是因为其缺少3'-5'外切核酸酶活性,不能纠正dNTP错误掺入。错误配对的延伸几率大大降低,减少了较长产物的产量。将Taq DNA聚合酶同带有3'-5'外切核酸酶活性的热稳定DNA聚合酶混合,可以扩增最高为30kb的目的片段。Platunum Pfx DNA聚合酶 ...

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〔共享〕影响PCR的主要因素

影响PCR的主要因素PCR技术必须有人工合成的合理引物和提取的样品DNA,然后才进行自动热循环,最后进行产物鉴定与分析。引物设计与合成目前只能在少数技术力量较强的研究院、所进行,临床应用只需购买PCR检测试剂盒就可开展工作,PCR自动热循环中影响因素很多,对不同的DNA样品,PCR反应中各种成份加入量和温度循环参数均不一致。现将几种主要影响因素介绍如下。  一、温度循环参数  在PCR自动热循环中,最关键的因素是变性与退 ...

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我也发篇关于pcR的文章(ZT)

增加PCR的特异性:1. primers design这是最重要的一步。理想的,只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火的引物要符合下面的 一些条件a. 足够长,18-24bp,以保证特异性.当然不是说越长越好,太长的引物同样会降低特异性,并且降低产量b. GC% 40%~~~~60% c. 5'端和中间序列要多GC,以增加稳定性d. 避免3'端GC rich, 最后3个BASE不要有GC,或者最后5个有3个不要是GCe. 避免3'端的互补, 否则容易造成DIMER f. 避免3'端 ...

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[分享]PCR基础

PCR基础分子生物学技术正以惊人的速度发展,特别是近20年来已经成为生命科学的一个主要的生长点。1976年cDNA克隆技术的建立,使分子生物学更加迅速广泛地渗透到医学各学科,发展了各学科的分子理论基础。1985年Mullis首先描述的多聚酶链反应( PCR, Polymerase Chain Reaction ),使一向昂贵、繁杂、严格的分子生物学试验能够在比较简易、经济的条件下有效的开展,是基因分析技术的一项重大突破。这一技术 ...

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【分享】荧光定量PCR问题解决方案

问题可能原因建议解决方法定量PCR 无扩增产量或很少的扩增产量DNA模板质量不好,含有抑制剂提高模板质量,诸如DMSO,SDS和甲酰胺之类的试剂会抑制Taq DNA聚合酶。如果怀疑污染了抑制剂,可以使用乙醇沉淀DNAPCR引物设计较差避免在引物3'端含有互补序列。避免可以形成内部发卡结构的序列。设计Tm类似的引物。探针设计较差对探针序列进行blast比对,设计符合要求的探针PCR引物合成较差用普通电泳法,看引物的设 ...

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【分享】使用韩国BIONEER荧光定量PCR仪发表的文章 (50篇)

使用Exicycler 96发表的文章Ref.#Reference1Dissection of the essential steps for condensin accumulation at kinetochores and rDNAs during fission yeast mitosisNorihiko Nakazawa, Takahiro Nakamura, Aya Kokubu, Masahiro Ebe, Koji Nagao and Mitsuhoro Yanagida.J Cell Biol. 2008 Mar 2 ...

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请大家给我看看这对引物是不是有问题

我的课题涉及到CYP1A1的多态,从文献上(cancer res等级别的文章,而且重复的人挺多)查到它的一个MspI多态位点引物为5’-CAG TGA AGA GGT GTA GCC GCT-3'和5’-TAG GAG TCT TGT CTC ATG CCT-3’,但我有扩增出了其他引物的条件都没有能扩增出这对引物的目标带,做梯度从48到65度都没有带出来。下面是所查的该引物的Blast的资料和该基因这个位点的基因序列资料,请高手帮忙分析一下到底这对引物可不可以扩 ...

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PCR引物设计原则

Primer designThe gene of interest usually has to be amplified from genomic or vector DNA by PCR (polymerase chain reaction) before it can be cloned into an expression vector. The first step is the design of the necessary primers.Important features are:Primer sequence. Especially the 3'-end of t ...

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【分享】Molecular Biology Problem Solver: A Laboratory Guide.

PCR问题及解决内容:Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 292Developing a PCR Strategy: The Project Stage . . . . . . . . . . . . . 293Assess Your Needs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 293Identify Any Weak Links in Your PCR Strategy . . . . . . . . . . 295Manipulate the Reaction to Meet Your Needs . . . . . . . . . . 296Developing a PCR Strategy: The Experimental Stage . . . . . . . 296What Are the Practical Cr

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请高手帮忙设计引物

拟扩增408位至3533位,插入真核表达载体pCAGGS扩增,请高手帮忙设计引物,指点一下不胜感激!1 agaagtttat ctgtgtgaac ttcttggctt agtatcgttg agaagaatcg agagattagt61 gcagtttaaa cagtttttta gaacggaaga taaccatgac taaaaaacca ggagggcccg121 gtaaaaaccg ggctatcaat atgctgaaac gcggcctacc ccg ...

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紧急求救引物设计,请高手们帮我看看

我现在急需做试验,但是我的引物还没有设计出来,所以万分着急。我想做XIAP 的RT-PCR,我现在找到它的mRNA序列为1 gaaaaggtgg acaagtccta ttttcaagag aagatgactt ttaacagttt tgaaggatct61 aaaacttgtg tacctgcaga catcaataag gaagaagaat ttgtagaaga gtttaataga121 ttaaaaactt ttgctaattt tccaagtggt agtc ...

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哪一个引物好啊?

准备用RT-PCR扩Sema3b(NM_004636) .1 gggcgggggc tgcttcttaa aggagccgtc agagggtccc cagcggcccc agggtgggaa61 ggggccagag tggagagatg ctgctgcgga agtcctcggt ggagtgtgag aaggcagcca121 gtgttggcct ggaagacctc tagaacctga gaagaggcag cgatcctggg gcagagtcca181 gggca ...

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【公告】4月份上旬0应助贴--加分从优!

本版块发帖量实在太多,因此分2个帖(上中旬和中下旬)分别帖出0应助贴,望大家积极响应,呵呵,有点浩如烟海的感觉哦http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=3091491&sty=1&tpg=34&age=0http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=3085000&sty=1&tpg=35&age=0http://www.dxy.cn/bbs/post/view?b ...

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自己设计的引物,马上要送公司了,急请帮忙验证!

1 gttaaaaatc tatagagatg gacactatcg ccgcaagagc actcactgtg atgcgagcat61 gtgctacgct tcaagaggca agaattgtgt tggaagccaa tgtgatggaa attttgggga121 tagctatcaa taggtacaat ggactcactt tacgaggagt gacgatgcgc ccgacctcgt181 tagcacaaag aaatgagatg ttttttatgt gtt ...

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第一次设计引物,请大家给评价一下!多谢!!

上游引物 5’-GGAA CCAGTTCGTC CCCAGCCAA -3’下游引物 5-CACCAAAGTCCCAGGAGGCCG-31 cggcctcaac aacgtccctt actccgccaa gagcagctat gacctgggct acaccgccgc61 ctacacctcc tacgctccct atggaaccag ttcgtcccca gccaacaacg agcctgagaa121 ggaggacctt gagcctgaaa ttcggatagt gaacg ...

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帮我看看我的引物是不是有问题!

Homo sapiens v-my... LinksLOCUS NM_005378 2458 bp mRNA linear PRI 21-DEC-2003DEFINITION Homo sapiens v-myc myelocytomatosis viral related oncogene,neuroblastoma derived (avian) (MYCN), mRNA.ACCESSION NM_005378VERSION NM_005378.3 GI:34147496ORIGIN1 ctccggtgtg t ...

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太郁了,怎么都出不来,请大家分析分析

我在克隆一个基因,以前的师姐做出来了,由于找不到原来的引物,我又重新设计,前后设计了两引物,用primer5检测都很好,就是P不出来,请各位高手指教,究竟哪里出了问题。附上我的基因mRNA及我所设计的引物,反应参数等条件。mRNA序列:其中CDS在315-5871 ctgcgcagat gaggggagac tcgtcaccag gcgtgcagtg ggcactgctg ggctccccca61 tcccgtccta acccggaaca g ...

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请高手帮忙设计引物,非常感谢!

我需要设计引物,将两条片段用45bp的linker连起来, 并且在片段2的3’端加上30个bp 的tag和两个酶切位点,我已经被困惑了很长时间,希望有高手帮帮忙,非常感谢!片段1:5’ACCATGGCTGTCTTGGGGCTGCTCTTCTGCCTGGTGACATTCCCAAGCTGTGTCCTATCCCAGGTGCAGCTGAAGCAGTCAGGACCTGGCCTAGTGCAGCCCTCACAGAGCCTGTC ...

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[旧贴整理]RACE整理,欢迎大家跟贴讨论

RACE使用对象http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/2785112_0.htmlRACE原理http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=64&id=1342728&sty=3&keywords=RACEhttp://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/806243_0.htmlhttp://www.dxy.cn/bbs/thread ...

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RT-PCR新手上路急盼园主等前辈帮助!!!!

我是一名新手,最近准备做一项RT-PCR检测小鼠脾组织含某种病毒的工作,刚接触分子生物学,在丁香园上看了诸多帖子,感觉是受益非多。但由于没有实践,很多东西仅停留在感性认识,有些还不怎么懂,希望得到前辈的帮助。1.脾组织的磨碎:我询问并参观了学校的有关老师的做法:在用Triol提的时候,是把脾组织称取50mg放入1.5ml离心管内,加入提取液后,然后用眼科剪剪碎,之后用手拿离心管按在磁力涡旋混匀器打悬,由于剪刀一下很 ...

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