实时荧光PCR检测技术众所周知，PCR（聚合酶链反应）技术自从1985年问世以来，经过十几年的发展，已成为实验室的常规技术。它是现代分子生物学研究中不可缺少的手段，是一种极为敏感的放大系统。相比于传统的临床诊断方法，核酸诊断是分子水平上的诊断技术，可以弥补传统临床诊断方法的某些缺陷，比如，核酸诊断能直接揭示病原体的存在，能客观反映病原体在人体内感染及活动情况，可以作为临床治疗中的一个有效监控手段，另外采用核酸诊 ...
很抱歉，这阵子忙了好久，没有时间来写后续的部分。因为第一次写的时候承诺过继续写下去的 http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=323830&sty=3 希望没有让等待的战友太失望。言归正传：这一次谈一下逆转录酶和逆转录反应的问题，在一般的逆转录反应中，较常用的是MMLV（鼠源的）和AMV（禽源的）两种，现在更有各家公司推出的耐热的（50-60度）、超长片段的逆转录酶，这方面具有专长的数gib ...
为了方便大家系统理解操作RT-PCR，开个帖子,把有关有RT-PCR相关的问题一起统一回答.如果有重复的问题，或者本帖的回帖中能自行找到答案的问题不会作答。现在将每一页的主要问题整理一下1. RNA 抽提中自备有机溶液的配制及保存问题2. 植物组织RNA提取的难点及对策3. 如何确定RNA质量的经验谈4. RNA提取常见问题分析RNA 抽提中自备有机溶液的配制及保存问题 (ZHUAN )假定你抽提 RNA 时使用到的有机试剂 - 氯仿、异丙醇、无水乙醇 - 都是国 ...
PCR常见问题总汇 PCR产物的电泳检测时间 一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。 假阴性，不出现扩增条带 PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及， ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消 化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模 板核酸变性不彻底。在 ...
琼脂糖凝胶的制备1、 取5×TBE 缓冲液20ml 加水至200ml,配制成0.5×TBE 稀释缓冲液,待用。2、 胶液的制备：称取0.4g 琼脂糖,置于200ml 锥形瓶中,加入50ml 0.5×TBE 稀释缓冲液,放入微波炉里(或电炉上)加热至琼脂糖全部熔化,取出摇匀,此为0.8％琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动,使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。加热时应盖上封口膜,以减少水份蒸发。3、 胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏(宽约1cm)紧密封住。将封好 ...
一 问题与解决大片段DNA的电泳问题一个含有8KB,16KB,20KBDNA的样品，需要跑琼脂糖电泳分离、鉴定和回收，请问：1、用0.5％的胶行不行？ 2、用什么样的MARKER，从哪里可以买到？1）最好用低熔点的胶了，但是回收的盒子可要选好的，片断太大了，回收的效率不高，0.5%的胶很嫩的,要小心。实在不行可以用0.7%的,30伏左右低电压,最好把电泳槽放在冰箱里,低温下电泳.这种大小的ＤＮＡ根本无需０．５％的凝胶，用１％即可。DNA ...
琼脂糖电泳步骤之超级基础篇----对论坛的一些帖子和个人的看法做个汇总，欢迎大家多多指正。一、电泳前准备准备内容作用1.刷干净电泳制胶的梳子，板子，槽子，蒸馏水洗净晾干防止不必要的重复污染，减少外来的污染。梳子干净有利于梳孔的形成。2.检查电泳槽，根据情况更换buffer排除电泳槽的电极接触不良，确保buffer的缓冲能力，减少污染。3.根据DNA的分离范围选择合适的胶浓度并记录达到较好的分离效果，防止样过快跑出胶或 ...
甲基化特异性 PCR(Methylmion Specific PCR，MSP)及其改进方法是检测基因甲基化的经典方法．MSP法的原理是首先用亚硫酸氢钠修饰处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶都被转化为 尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则不变。然后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物并进行聚合酶链反应(PCR)扩增，最后通过琼脂糖凝胶电泳分析，确定与引物互 补的DNA序列的甲基化状态。MSP法灵敏度较高，应用范围广。MSP 实验流程： 抽提基因 ...
刚才看到一个老兄讲到提高RNA浓度的方法,认为与离心的速度有关,其实不然.本人提的组织RNA的浓度,OD260/280值都在1.8-1.95之间,其中在相分离时上清吸取时不要吸到下一层很重要.本人现贴上TRIZOL说明书的RNA操作步骤,其中本人根据实验室的经验加以补充,供各位参考.Trizol 法提取RNA实验步骤需要的试剂：氯仿异丙醇75%乙醇（in DEPC-treated water)RNase free水或者0.5% SDS溶液 ...
MLPA是一种高分辨率检测基因组序列中变异重复拷贝数的新方法，能检测到新的缺失和扩增， MPLA可以检测单一外显子的拷贝数的改变，能检测50～70个核苷酸的片断，操作只需要一台基因扩增仪和序列电泳系统。在相同的操作协议下MPLA有不同的应用。MPLA可以对上达40不同的mRNA进行相对定量检测，以测定启动子甲基化状态，并可检出已知的突变和SNPs。因为探针具有非常短的识别序列MPLA可以用于局部降解的DNA，比 ...
PCR技术：PCR片段拼接的SOE和SDL方法PCR技术（多聚酶链式反应）是现代分子生物学的一个巨大突破，它能在体外迅速、 大量、灵敏地扩增基因片段。可是，经PCR技术扩增的大量相关基因片段如何能有效 拼接，却是一个很值行探讨的问题。传统的方法是引入限制性内切酶位点，这不但操 作繁杂，而有时为了构建限性位点还会影响解读三联密码的正确性。本介绍两种基因 拼接的新方法，即SOE和SDL法，就能巧妙地解决这个问题。SOE法 1989年，H ...
1，降落PCR中引物TM相差过大如何设定退火温度http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=1383577&sty=3&keywords=%BD%B5%C2%E4PCRhttp://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/3004779_0.html2，降落PCR的结果分析http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/602867 ...
1.SNP的定义http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/1022204_0.htmlhttp://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/1094366_0.htmlhttp://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/1718873_0.htmlhttp://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/6 ...
Validation of a quantitative method for real time PCR kineticsAbstractReal time RT-PCR is the most sensitive method for quantitation of gene expression levels. The accuracy can be dependent on the mathematical model on which the quantitative methods are based. The generally accepted m ...
PCR引物银行是目前国际上最大的引物数据库，里面有超过18万种引物序列，它的引物序列能用于一般 的PCR，也能用于定量PCR，你只要输入基因针对的ID号（可以通过NCBI查询），这样就能得出引物序列。甚至你也可输入基因的名称，或蛋白质的名称，或者对应的Locallink都可以查到。目前引物主要针对人和小鼠的，今后将拓展到其它物种，如大鼠等。它的引物成功率达到99%，我想大家应该放心使用了吧。这个文章来源于一篇华人的文 ...
感觉很不错的网站，你可以找到你想要的实验方法，也是你解决实验中遇到问题的地方，protocol online试验方法在线http://www.protocol-online.org/http://www.bioprotocol.comhttp://www.protocol-online.netwiley公司的Current Protocol Online系列http://www.dxy.cn/bbs/post/view? ... p;keywords ...
1。引物二聚体形成的原理：http://www.dxy.cn/bbs/thread/5251134http://www.dxy.cn/bbs/thread/52543942。怎样区分引物二聚体http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/553209_0.html3。引物二聚体在什么情况下需要注意http://www.dxy.cn/bbs/actions/archive/post/553338_0.h ...
Nat Med杂志于 2008.4.13在线发表了一篇文章，该文章报道了一种新的PCR技术 COLD-PCR 可补足常规PCR在检测DNA低水平突变中的不足，将革命性的转变常规PCR在遗传病检测，癌症，感染性疾病，产前诊断中的能力。Replacing PCR with COLD-PCR enriches variant DNA sequences and redefines the sensitivity of genetic testing.Li J, Wang L, Mamon H, Kulke MH, Be ...
有价值但无法归入其他话题，就先单独放在这里吧。full sequence of pGEX-4T-1http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=323868&sty=1&tpg=48&age=0如何测等位和单倍型基因频率http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=67&id=636538&sty=1&tpg=7&age=0确诊丙肝http://www.dxy.cn/bbs/post/view ...
要进行RT-PCR的序列就是 Oryctolagus cuniculus glucocorticoid receptor1 atggactcca aagaatcatt aagtcccccg ggtagagagg aggtccccag cagtgtgctc61 aggccggcgg agcgcgggaa tgtgatggac ttgtacaaaa ccctaagggg aggagctcct121 gtgagggtgc ctgcatcttc tccctcactg gctcctgc ...
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