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dmdfe 本人将GFP基因后面加了一段大约110bp的序列，插入PET28A的BamH1和Hind3位点，最后在BL21中表达。经SDS-PAGE验证表明：目的蛋白 大量存在菌体裂解后沉淀即包涵体中，但是该沉淀无色。少量存在于上清中，上清显微弱的绿色。看文献大量报道GFP融合蛋白几乎都形成可溶性表达，目的蛋白在上清中，并且诱导条件没有太大要求。想请教一下各位做过GFP原核表达的经验，本人应该怎么改进条件（本人用37度 ...

a_a1 如题。kern6549 LPS不能进入细胞吧！a_a1 lps的信号转导除了 通过TLR还有什么其他途径么kern6549 我印象中好像只能通过TLR4。本文由丁香园论坛提供，想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你，都可以成为师兄的好伙伴师兄微信号：shixiongcoming

zhang201009 请各位高手指点！我要做MAPK通路P38，JNK,ERK三个蛋白的表达及磷酸化水平以及下游炎症因子变化情况，这三个需要同时检测吗？还是我只选择其中一个就可以呢？这三个抑制剂SB202190，PD98059，SP600125都需要用呢还是只用其中一个就可以？xinfangyu 同时做三个，分别检测。tacitlee 首先，做哪个要取决于你的实验目的。P38，JNK,ERK在不同的组织或细胞中的重要性是 ...

lingwu 做WB,加入药物，发现p-AKT在60min表达才开始上升，而其他信号分子在15min内就表现出磷酸化增加，这种现象如何解释，p-AKT在60min表达上升有什么意义？kern6549 可能是间接作用，就是药物作用后细胞分泌某细胞因子，该细胞因子通过自分泌的方式作用于自己导致p-AKT上升。lingwu 谢谢战友！这种情况能不能就排除药物的直接作用？kern6549 当然只是猜测，想要明确当然需要你进一步研究了。本 ...

linaque 本人没做过RNA干扰，想请教一个问题，可以在整体动物上沉默某个基因的表达吗？还是只能在细胞水平沉默某基因的表达？还是说在整体水平若要沉默某基因只能通过敲基因的方法？谢谢！路得自己走 基于过表达miRNA（当siRNA用了）的转基因小鼠敲减Prnp的实验，不知是否符合楼主所说的。linaque 谢谢！kinguangjun 个人观点：基因敲除一般是在胚胎细胞水平上筛选出来（也可以用多条透导型ShRNA表达系统整 ...

大漠判官 循环microRNA是潜在的疾病标志物已经是共识了。现在已经有研究发现细胞间通过microRNA传递信息，即A细胞通过“旁分泌”的方式释放microRNA影响B细胞的功能。我突发奇想，循环microRNA会不会参与疾病的发病，从而具有治疗价值呢？比如，将microRNA mimics或者inhibitor直接注射到动物体内，能否发挥治疗作用呢？换句话说，就是降低或者增高循环中某种microRNA的水平，能否 ...

taijiwu 最近比较关注miRNA Sponge（海绵体），不知哪位高手做过啊，能否介绍一下使用方法，比如是否需要转染试剂或载体，那种较好，海绵体的用量多少等等，在CNKI理搜了一下，没发现这方面的文献，国内是不是用的少啊。zhujoker 其实我自己也做了不少这方面的工作，但是后来发现还是买比较省时省事。因为最重要的是我们耗不起这个时间。到现在我已经摸索了1年多了，还是没有找到一个合适的能够有效地载体。taijiwu 这个 ...

伽利略 线粒体中的内参？？？我在网上找到的这个介绍，但是没有更多内容，这个是不是通常被用来作为线粒体中的内参啊http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/439800_Rev1008.pdf谁了解，麻烦说说沈玉琳 线粒体的内参很多啊，我见过的比如complexIV，ABAD啊但是Complex V α subunit好像比较少吧具体能不能建议再看看文献伽利略 谢谢。。。。。。。。。。。本文由丁香园论 ...

dongxiao1214 各位大虾们，我现在急需慢病毒载体和他的包装载体，谁有的可以卖给我一套吗？我研二了，老板让做这些东西，还只能自己想办法，谁能帮帮我，不胜感激！！dongxiao1214 自己先顶一下，愿意帮忙的可以加我qq 315915365dongxiao1214 对了，过表达的和RNAi的都可以，如果都有更好，不过我现在希望做的是过表达。kinguangjun 你好！我这里有clontech的慢病毒包装系统质粒，滴度可以 ...

luke_zou full-length 16S rRNA gene sequence与partial sequence有什么区别？zhujoker 就是16s的全场序列以及部分序列luke_zou 请问是否取决于primer？本文由丁香园论坛提供，想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你，都可以成为师兄的好伙伴师兄微信号：shixiongcoming

cindy18180 各位好，小女子第一次做细胞转染，有许多问题想请教，请大家多多指导:)首先，我要获得我的目的基因,在genebank上面查到mRNA全长3526bp，cds：713-2767我想问是不是我要的目的基因的有效片段是2054bp，适合用什么方法获得呢？用RT-PCR会不会太长了，扩不出来，或者效果不好？急用，请教各位前辈zjubell 你应该是想做过表达吧，那你的质粒上应该有启动子的吧，比如CMV。那你只需要 ...

linaque 信号通路RhoA/ROCK中，ROCK特异性抑制剂我们一般采用Y-27632、fasudil等，若想研究ROCK活性上调，是否有ROCK特异性的激动剂呢?我查了很多文献都没查到。求助，谢谢！linaque 没人知道吗？急，谢谢！阿兰梦 'Lipid messengers such as arachidonic acid (AA) or sphingosine phosphorylcholine (SPC) are able to efficiently stimul ...

dongxiao1214 我是研二的学生，打算构建过表达载体和RNAi载体，想用慢病毒载体，但是慢病毒载体有好多，怎么选择一种最合适的呢？而且现在也没有慢病毒载体，公司都不卖的，我想问问，有慢病毒载体系统的可否卖给我一套，不胜感激。老板让我3月份就开始做实验，但是现在还没有材料，很着急，希望各位行行好，让我怎么感谢都可以。沈玉琳 1，如果什么材料都没有的话老板还让做，说明这个老板很水，鄙视2，建议找公司做，这样很快，而且现在 ...

llj1985 我构建了一个转录因子表达载体，用了pcDNA3.1(+)基础载体，转染进入293T后免疫荧光检测，发现只在胞质中有表达，不知道为什么，请达人指点！谢谢了devil19840 pcDNA3.1(+)上没有任何标签，你的荧光是什么荧光呢？GFP？如何连接上去的？如果是融合表达很多时候会有GFP的单体泄露表达，而GFP单体大部分就位于胞浆中。所以不如用WB检测一下你的蛋白是否有表达，表达状态如何，最好能用GFP抗体检 ...

zllxash 请问各位研究内质网应激的战友;1、在给予细胞的应激刺激后如何检测细胞的内质网应激程度，有没有一个定量的检测标准呢？2、如何判断内质网应激引起的未折叠蛋白的三条通路激活的判断方法？通过看文献发现有的查的是受体蛋白，有的查的是下游分子，有什么区别？十分感谢！juliyxu 你好，请你帮帮我，关于膀胱癌细胞UMUC3！谢谢您了！请您看到后能否尽快回复我！谢谢了！真的急需帮忙！我给您发站内信息了，急死了！我是华东理 ...

曾经在水一方 请教各位大侠，如何查找融合基因的mRNA序列？比如说PML/RARA，可以利用Map viewer 分别查出PML和RARA的mRNA序列，然后在融合位点拼接吗？有什么可用的方法，请大家帮我推荐一下。谢谢了bingbing6612 这是问题吗？学过分子生物学的都知道曾经在水一方 让您见笑了。还请您不吝赐教。本文由丁香园论坛提供，想了解更多有用的、有意思的前沿资讯以及酷炫的实验方法的你，都可以成为师兄的好伙伴师兄微信号 ...

birkin 我在尝试转染某种细胞，载体是购买的商业载体（pCMV6)，之前转染HEK293作为预实验，已经用WB证明有效，但是换到现在这种细胞之后就很奇怪，一开始想用短期转，结果WB做不出来，觉得可能是转染率太低，于是又改做稳定转染，用了G418筛选。花了近2个月，细胞稳定下来了，取样做RT-PCR，有相当强的mRNA表达（-RT和对照组转染也做了的，基本没有带，所以不会是污染），谁知做WB还是一点东西都没有……我都快疯了 ...

64249087 菜鸟求助：已知靶基因，怎样筛选相关的miRNA?lide658 可以通过一些生物信息学数据库先找到与之可能作用的miRNA，然后根据种子序列结合的程度以及其他参数进行选择，比较常用的是targetScan.当然还有很多，最好是选择在多个预测软件都能预测到的miRNA，在或者就是针对靶基因进行处理后，做miRNA芯片，这样针对性更强，但费用较高。64249087 谢谢了！elvayal 理论上,是所有的已知基因 ...

pangpangfish 小弟欲检测T细胞的端粒长度，以对比分选细胞寿命优势，鉴于经费很有限，请各位老师指导选择适宜的检测方法，主要是费用低，又比较容易实现的，先谢谢了。pangpangfish 补充一下，是小鼠的T细胞yxunm 楼主的问题解决了吗？能否告诉我有哪些备选？楼主最后选择了哪一种？P.S.实验室新手，菜鸟一只！有劳楼主！jackhui03 你好，我也想测端粒长度以及端粒酶活性，请问你找到方法了吗shylook jackh ...

feroger 看了很多文献上测p-Rb，用的是actin做的内参，没用总的Rb，这是为什么呢kern6549 怎么能用总的Rb作为内参，看来你没有弄明白什么是内参！feroger 测磷酸化不是要和总的对照吗？像测p-AKT还要同时测总AKT，为什么很多文献上测p-Rb，而不测总的Rb呢？kern6549 为什么一定要和总的对照呢？测磷酸化的和总的意义是不一样的，你想得到哪一种信息就测相对应的一个。测磷酸化的是关心的是活化的有 ...