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        请看我的60bpDNA片段的电泳图

        丁香园论坛

        3884
        这是我做PCR后跑的6%琼脂糖的电泳图。请各位分析一下,谢谢。
        我扩增的目的DNA只有59个碱基,一对引物只有12bp长,都是由公司合成的。我的反应体系如下
        Taq E.(5U/ul) 0.5ul
        1undefinedBuffer(Mg2+ free) 5ul
        MgCl2(25mM) 3ul
        undefineddNTP(各2.5mM) 4ul
        primer1(20uM) 2ul (Tm=51.4)
        primer2(20uM) 2ul (Tm=44.6)
        Template(10ng/ul) 10ul (59bp ssDNA)
        ddH2O 至50ul
        反应条件
        Cycle=30 Denaturation Annealing Polymerixation
        1st 94 2min V 30s 72 1min
        Subsequent 94 30s V 30s 72 1min
        Last 94 30s V 30s 72 5min
        其中退火温度从39.2到47.0分为8个梯度。
        图象中1-7反应条件如上述,8中没有加template,O4点的是200ng的59bp ssDNA,O44点的是50ng的59bp ssDNA。Marker没有选好,从8bp到580bp应有20多个条带,但跑不开。
        我觉得1-7中跑在溴酚蓝后面的很淡的条带应该是PCR的扩增产物(8中没有),请教各位,如何排除这不是非特异性扩增呢?跑在溴酚蓝前面的1-8都有的条带是什么呢?是primer dimer吗?
        我是刚开始学做PCR,现在也还在摸条件,各位大虾觉得有那些地方可以优化呢?有劳各位帮忙,也许我可以少走一些弯路,谢谢了!
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