斑马鱼胚胎DNA的制备

材料和试剂



1.        蛋白酶K（罗氏03115836001）

2.        1M的Tris，pH值8.3

3.        氯化钾

4.        吐温20（10％，EMD4 biosciences，655207）

5.        NP40（10％，Merck，492018）



设备



1.        PCR仪

2.        离心机

3.        孵化器



步骤



1.        冷冻单活胚胎

1)      E3洗涤dechorionated胚胎3X。

2)      将一个单个的胚胎放入一个96孔板，并移除所有多余的缓冲液。

（如果需要，干燥保存于-20°C）。

2.        DNA的制备：

1)      添加50μl裂解液到单个的胚胎（活体或在situ'd）。

2)      在98 °C孵育10分钟裂解细胞。自旋向下。

3)      加入5μl蛋白酶K（10 mg / ml的储存液）到单个的胚胎。

4)      在55 °C孵育至少2个小时（长与孵育期，清除DNA）

5)      在98 °C孵育至热灭活蛋白酶K

6)      涡旋彻底和自旋出现碎片。

7)      单个胚胎的DNA 每次PCR rxn使用2μl。



配方



1.        1X PCR缓冲液：

配制50 ml：

10 mM的Tris - HCl pH值8.3（500μl 1M的Tris（pH值8.3）

50 mM氯化钾（2.5 ml的1 M氯化钾）

无菌水47 ml

（可在室温下保存几个月）

2.        胚胎细胞裂解液：（含有吐温20和NP40的1X PCR缓冲液）

配制10 ml裂解缓冲液中：

1X  PCR缓冲液9.4 ml

300μlNP40（10％的储存液）**现用

300μl  tween20（10％的储存液），现配**~Kbr_~H~M~2~1~0~0~0~0~0~0~Kbr_~H~M~2~1~0~0~0~0~0~03.        E3

60X E3的股票（2L）

34.4克氯化钠

1.52克氯化钾

5.8克CaCl2.2H2O

9.8克MgSO4.7H2O

加蒸馏水至2000 ml

储存在室温下。

饲养斑马鱼时稀释成1X，使用160 ml的储存液，并填加ddH2O至10L。 (责任编辑：大汉昆仑王)