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        显微注射质粒DNA技术修饰斑马鱼基因

        相关实验:斑马鱼遗传修饰技术

        最新修订时间:

        简介

        显微注射质粒DNA技术修饰斑马鱼基因,是通过使用组织特异性的启动子以及荧光标记基因,综合斑马鱼胚胎的诸多优势,特别是早期发育通体透明,易于观察的特点,获得转基因斑马鱼。

        材料与仪器

        器材:

        拉针仪、显微注射器、持针器和显微操纵器、体视显微镜

        试剂:

        DNA 质粒样品

        步骤

        显微注射质粒 DNA 技术修饰斑马鱼基因的基本过程可分为如下几步:

        A. 斑马鱼胚胎显微注射质粒 DNA;

        B. 在显微注射后的胚胎(T0)发育到性成熟期后,与未注射过的鱼交配、待它们所产的卵发育到一定时期放在荧光显微镜下观察;

        C. 如果迟至受精后 48 小时都观察不到有荧光表达的胚胎,则将这些胚胎及其显微注射过的亲本淘汰;如果发现有约 50% 的胚胎表达荧光,则将荧光阳性胚胎 (T1 代)挑出来饲养,这些胚胎的基因组中必然已整合了转基因表达载体,将荧光阴性胚胎淘汰。

        D. 为获得转基因纯合体,将发育到性成熟的 T1 代个体做全同胞间交配以产生 T2 代;

        E. 将 T2 代中的荧光阳性个体与野生型成年鱼一对一交配、取每对鱼产下的至少 100 个 1~2 天龄胚胎在荧光显微镜下观察,如果它们全部都表达荧光,则该 T2 个体为纯合体,将 T2 养大为成鱼以繁殖转基因纯合群体;如果某对鱼产下的胚胎中仅部分胚胎为荧光阳性.则其荧光阳性亲本为杂合体或者它从父母 (T1 代)遗传了整合位置不同的 2 个荧光转基因.我们在实际工作中将这类荧光阳性个体淘汰;

        F. 鉴定出的 T2 代纯合体间的同胞交配,产生的后代将全部是转基因纯合体,由此可以使转基因纯合体得到长期保存。

        来源:丁香实验

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