【资源】elispot的实验流程
丁香园论坛
2601
1. ELISPOT
包被抗体：
1. 按1：200比例稀释，将包被抗体加入到4℃储存的1×PBS中，在ELISPOT平板每孔中加入100μl稀释后的包被抗体；
2. 置于4℃冰箱封闭过夜（16小时）；
封闭：
3. 弃去包被抗体稀释液。每孔加入200μl含10%牛血清的RPMI1640培养基清洗，放置2分钟；
4. 每孔加入200μl的含10%牛血清的RPMI1640培养基，室温放置2小时；
刺激细胞：
5. 弃去每孔中的200μl的含10%牛血清的RPMI 1640培养基；
a) 阴性孔：在11列中加入20μl含10%牛血清的RPMI1640培养基；
b) 阳性孔：在12列中加入5μl的10μg/ml的PMA和2μl的1mg/ml的Ionomycin；
c) 实验孔：实验孔每孔加入8μl的100μg/ml的多肽；
6. 每孔加入180μl的1.5×106/ml小鼠脾细胞悬液；
7. 37℃ 5%CO2 孵育24小时；
加入检测抗体：
8. 吸弃细胞。每孔中加入200μl去离子水，室温放置5分钟，再次加入200μl去离子水，室温放置5分钟；
9. 每孔用200μl 1×PBST清洗3次，每次室温放置2分钟，弃去PBST；
10. 按1：250比例稀释，将检测抗体加入到含10%血清的1×PBS中，ELISPOT平板每孔加入100μl稀释后的检测抗体；
11. 室温放置2小时；
酶联：
12. 弃去检测抗体稀释液。每孔用200μl 1×PBST清洗，共3次，每次室温放置2分钟；
13. 按1：100比例稀释，将亲和素-HRP加入到含10%血清的1×PBS中，ELISPOT平板每孔加入100ul酶联稀释液；
14. 室温放置1小时；
显色：
15. 弃去酶联稀释液。每孔用200μl的1×PBST清洗4次，每次放置2分钟；
16. 每孔用200μl的1×PBS清洗2次，每次放置2分钟；
17. 每孔加入AEC显色液100μl，室温避光放置10～30分钟，其间观察是否形成斑点；
18. 斑点形成后，用去离子水冲洗终止酶联反应；
19. 取下垫盘，室温干燥过夜；
20. 使用CTL ELISPOT读数仪，读取分析数据，ELISPOT平板放入自封袋室温保存。
以上是我们实验室常用的elispot的流程，供大家参考。也请大虾们不吝赐教，给以建议和帮助。
包被抗体：
1. 按1：200比例稀释，将包被抗体加入到4℃储存的1×PBS中，在ELISPOT平板每孔中加入100μl稀释后的包被抗体；
2. 置于4℃冰箱封闭过夜（16小时）；
封闭：
3. 弃去包被抗体稀释液。每孔加入200μl含10%牛血清的RPMI1640培养基清洗，放置2分钟；
4. 每孔加入200μl的含10%牛血清的RPMI1640培养基，室温放置2小时；
刺激细胞：
5. 弃去每孔中的200μl的含10%牛血清的RPMI 1640培养基；
a) 阴性孔：在11列中加入20μl含10%牛血清的RPMI1640培养基；
b) 阳性孔：在12列中加入5μl的10μg/ml的PMA和2μl的1mg/ml的Ionomycin；
c) 实验孔：实验孔每孔加入8μl的100μg/ml的多肽；
6. 每孔加入180μl的1.5×106/ml小鼠脾细胞悬液；
7. 37℃ 5%CO2 孵育24小时；
加入检测抗体：
8. 吸弃细胞。每孔中加入200μl去离子水，室温放置5分钟，再次加入200μl去离子水，室温放置5分钟；
9. 每孔用200μl 1×PBST清洗3次，每次室温放置2分钟，弃去PBST；
10. 按1：250比例稀释，将检测抗体加入到含10%血清的1×PBS中，ELISPOT平板每孔加入100μl稀释后的检测抗体；
11. 室温放置2小时；
酶联：
12. 弃去检测抗体稀释液。每孔用200μl 1×PBST清洗，共3次，每次室温放置2分钟；
13. 按1：100比例稀释，将亲和素-HRP加入到含10%血清的1×PBS中，ELISPOT平板每孔加入100ul酶联稀释液；
14. 室温放置1小时；
显色：
15. 弃去酶联稀释液。每孔用200μl的1×PBST清洗4次，每次放置2分钟；
16. 每孔用200μl的1×PBS清洗2次，每次放置2分钟；
17. 每孔加入AEC显色液100μl，室温避光放置10～30分钟，其间观察是否形成斑点；
18. 斑点形成后，用去离子水冲洗终止酶联反应；
19. 取下垫盘，室温干燥过夜；
20. 使用CTL ELISPOT读数仪，读取分析数据，ELISPOT平板放入自封袋室温保存。
以上是我们实验室常用的elispot的流程，供大家参考。也请大虾们不吝赐教，给以建议和帮助。
