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        聚合酶链式反应(PCR)详细步骤

        互联网

        24913

        一、准备工作

        1、实验器具与材料:

        (1)移液枪:200ul、10ul

        (2)吸头:200ul、20ul

        (3)吸头台:放置200ul和20ul的吸头一个

        (4)EP管1.5ml、100ul

        2、实验器具的处理与准备

        塑料制品:(包括吸头、EP管等)

        送至高压3次,试验前将枪头放入吸头台。

        3、试剂配制和准备:

        (1) 双蒸水: 100ml盐水瓶内装40ml蒸馏水,送至高压,后分装到几个1。5mlEP管中,-20℃中保存备用。

        (2) PCR中所需要的各种试剂

        二、PCR时注意事项:

        佩戴一次性手套,同时避免戴上的一次性的手套接触可疑污染物。

        三、PCR步骤

        1、准备100ul EP管

        2、依次在管中加入:(50ul反应体系)

        ddH2O37.5ul×?
        10mM dNTP1ul×?
        10×PCR buffer5ul×?
        25mM MgCl2
        (加之前要摇匀)
        3ul×?
        上游引物1ul×?
        下游引物1ul×?
        模板cDNA1ul

        3、稍离心

        4、100℃沸水浴1分钟

        5、趁热加入Tag酶0.5ul(冰上操作)

        6、再加入50ul液体石蜡封闭

        7、10000rmp离心1分钟

        8、PCR条件

        94℃ 1min

        58℃ 50sec

        72℃ 1min30sec

        进行40个循环,然后72℃ 10min 完后4℃保温。

        9、10000rmp离心5min

        10、将下层水相转入新的0.65mlEP管中,-20℃保存。

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