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        内切酶在PCR反应产物中的活性(Activity of Restriction Enzymes in a Primer Extensio

        互联网

        2501

        通常PCR反应以后还要对产物进行酶切才能进入下一步工作。为了方便起见,我们可以将内切酶直接加入到PCR反应产物中去,而省略了纯化产物的步骤。下表归纳了在PCR产物混合物中各种限制性内切酶的酶切活性。

        酶切反应条件如下:在20 µl PCR产物混合体系中加入5U的内切酶,按相应的反应温度温育1小时。通常20 µl PCR产物体系中含有1 µg底物DNA,1单位的Vent DNA聚合酶,1× ThermoPol Buffer [10 mM KCl, 20 mM Tris-HCl (PH 8.8@25℃),10 mM (NH4 )2 SO4 , 2 mM MgSO4和0.1% Triton X-100],以及终浓度为200 µM的dNTPs。表中标记有的内切酶在酶切反应前需加入NaCl(终浓度为100 mM)或相应的10× NEBuffer(1×终浓度)。

        注意:在非最佳条件下进行酶切反应容易出现星号活性。要避免星号活性或希望取得更好的酶切效果,则需用乙醇沉淀纯化DNA,再将其溶解于相应的酶切缓冲液。此外,如果使用不纯的DNA聚合酶,会因其中混有其它核酸酶而影响整个反应结果。

        +++表示完全切割;++表示约50%被完全切割;+表示约25%被完全切割。

        | A | B | C | D | E | F | H | K | M | N | P | R | S | T | X | 

        酶     在反应物中的活性
          Acc I      +  
          Acc65 I   + +  
          Aci I        + + +  
          Acl I     + +  
          Afl II     + + +  
          Afl III   + +  
          Age I   + + +  
          Ahd I   + +  
          Alu I   + + +  
          Alw I   + +  
          AlwN I   + +  
          Apa I   + ++  
          ApaL I   + + +  
          Apo I   + +  
          Asc I   + + +  
          Ase I   +  
          Ava I   + + +  
          Ava II   + +  
          Avr II   + + +  
           none 
          BamH I   + + + 
          Ban I   + + +  
          Ban II   + + +  
          Bbs I   + + +  
          Bbv I   + +  
          Bcg I   + +  
          BciV I  + +  
          Bcl I   + + +  
          Bfa I   none 
          Bgl I   +  
          Bgl II   + + +  
          Blp I   + + +  
          Bmr I  + + + 
          Bpm I   + +  
          Bsa I   +  
          BsaA I   + + +  
          BsaB I   + +  
          BsaH I   + + +  
          BsaJ I   + + +  
          BsaW I   + +  
          BseR I   + + +  
          Bsg I   + +  
          BsiE I   + +  
          BsiHKA I *   + +  
          BsiW I   + +  
          Bsl I  + +  
          Bsm I   + + +  
          BsmB I   + +  
          BsmF I   + +  
          BsoB I   + + +  
          Bsp1286 I   + + +  
          BspD I   + +  
          BspE I *   + + +  
          BspH I   + +  
          BspM I   none 
          Bsr I   + + +  
          BsrB I   + + +  
          BsrD I   + +  
          BsrF I   + +  
          BsrG I   + +  
          BssH II   + +  
          BssK I   + +  
          BssS I   + + +  
          BstB I   + + +  
          BstE I   + + +  
          BstN I   + +  
          BstU I   + +  
          BstX I   + + +  
          BstY I   + +  
          BstZ17 I   + +  
          Bsu36 I   + + +  
          Btg I  + + + 
          Bts I  + + +  
          Cla I   + +  
          Dpn I   (none, requires methylated substrate)  
          Dpn II   + + +  
          Dra I   + +  
          Dra III *   + + +  
          Drd I   + +  
          Eag I   +  
          Ear I   + + +  
          EcoN I   + +  
          EcoO109 I   + + +  
          EcoR I   + +  
          EcoR V   + + +  
          Fok I   none 
          Fse I   + + +  
          Fsp I   + +  
          Hae III   + + +  
          Hga I   + + +  
          Hha I   + +  
          Hinc II   + +  
          Hind III   + + +  
          Hinf I   + +  
          HinP1 I   + + +  
          Hpa I   + + +  
          Hpa II   + + +  
          Hph I   + + +  
          Kpn I   + + +  
          Mbo II   + + +  
          Mfe I   + +  
          Mlu I   + +  
          Mly I  + + + 
          Mnl I   + + +  
          Msc I   + +  
          Mse I   + +  
          Msl I   + + +    

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