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        提高平端连接效率的方法

        互联网

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        1、低温下长时间的连接效率比室温下短时间连接的好,平端连接需要过夜反应。

        2、在体系中加一点切载体的酶,只要连接后原来的酶切位点消失。这样可避免载体自连,应该可以大大提高平端连接的效率。

        足够多的载体和插入片段是最重要的 。要看片段具体情况而言,有时载体和片段浓度过高,容易产生线性化产物,不利于环化的。插入的DNA的摩尔数是载体摩尔数的5-10倍,这个很关键。载体通常50ng就够了,若载体在10k左右,可用50-100ng。

        3、平端的连接对于离子浓度很敏感,回收的时候多洗洗,加PEG和扩大酶量,22度2小时后4℃过夜。

        4、尽可能缩小连接反应的体积,最好不超过10微升,在5、6微升左右最佳。

        5、建议放在四度冰箱连接两天效率更高比14度好。

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