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        λ噬菌体臂与外源基因组DNA片段的连接实验

        相关实验:λ噬菌体臂与外源基因组 DNA 片段的连接实验

        最新修订时间:

        原理

        当 λ 噬菌体臂与外源基因组 DNA 片段相连时,必须考虑到两个参数:噬菌体臂与潜在插入片段的摩尔比,以及在反应混合物中各类 DNA 的浓度。

        材料与仪器

        步骤

        一、材料

        1. 缓冲液和溶液

        ATP ( 10 mmol/L)

        SM 和 SM+ 明胶

        2. 酶和缓冲液

        噬菌体 T4 DNA 连接酶

        3. 凝胶

        琼脂糖凝胶(0.7%), 用 0.5X TBE, 含 0.5 μg/ml 溴化乙锭

        4. 核酸和寡核苷酸

        适当大小的基因组 DNA,用于载体克隆

        5. 培养基

        LB 或 NZCYM 琼脂平板

        LB 或 NZCYM 顶层琼脂糖

        6. 专用设备

        预置于 47℃ 的加热仪或水浴(用于顶层琼脂糖)

        预置于 16℃ 的水浴

        7. 载体和菌株

        λ 噬菌体包装混合物

        λ 噬菌体臂 DNA

        二、方法

        1. 建立含有如下物质的一系列连接反应:

        λ 噬菌体臂 0.5~1.0 μg,部分酶切基因组 DNA 6~1200 ng,10X 连接缓冲液 0.5~1.0 μl,10 mmol/L ATP(若必需) 0.5~1.0 μl,噬菌体 T4 DNA 连接酶 0.5~1.0 μl,水 至 5 或 10 μl。

        建立两个对照反应,其中载体和插入 DNA 任缺其一。将连接反应置 16℃ 温育 4~16 h。

        为了获得最大的连接效率,建立体积尽可能小的反应体系(5~10 μl)。若 ATP 作为 10X 连接缓冲液的一种组分加入反应混合物中,则将给载体或外源 DNA 留出更大的体积。

        如果应用含 ATP 的商品化连接缓冲液,则省略 ATP。

        2. 在各连接反应中取 10%~25% 的组分,按照生产商提供的关于包装提取物的说明包装入噬菌体颗粒。

        大多数的生产商都提供入噬菌体 DNA 对照,作为检测包装效率的标准。

        3. 将包装反应进行 10 倍系列稀释(10-1~10-5),用 SM+ 明胶或厂家推荐的相应缓冲液作为稀释液。

        4. 分析每个稀释度 1 μl 和 10 μl 所形成噬菌斑的数量。

        5. 从得到感染性噬菌体颗粒最多的连接反应中,挑取 6~12 个噬菌斑,从每个噬菌斑制备小量重组 DNA。

        6. 用适当的限制酶消化,随后进行 0.7% 的琼脂糖凝胶电泳,并使用适宜的分子质量标准,检测所插入基因组 DNA 的大小。

        7. 如果噬菌体是重组子且含有合适大小的插入片段,则通过建立多个连接和包装反应构建基因组 DNA 文库。在这些反应中插入片段和载体 DNA 的比值应是,在试反应中产生最多重组噬菌斑所采用的比值。

        8. 估算大规模连接和包装反应所产生的所有重组噬菌斑的量,并计算如此大小的文库所能覆盖整个目标基因组的程度。

        为了对某一哺乳动物基因组(3X109 bp ) 提供一个 5 倍的覆盖率,则一个平均含有 20 kb 插入片段的 λ 噬菌体文库需包含 2X106 个独立的重组子。

        来源:丁香实验

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