类器官培养与应用——血管类器官

血管是胚胎最先发育的器官之一，是所有其它器官功能的基础。

血管系统由两种细胞类型构成：内皮细胞 (Endothelial cells) 和壁细胞 （Mural cells），其中壁细胞是周细胞 （Pericytes, PC） 和血管平滑肌细胞 （Vascular smooth muscle cells, vSMCs） 的统称。

内皮细胞组成血管的内壁，是血管管腔内血液及其他血管壁 （单层鳞状上皮） 的接口；而壁细胞在保持血管壁的完整性方面起着关键作用^【1】。

在发育过程中，在成纤维细胞生长因子 2  (FGF-2) 、骨形态发生蛋白 4  (BMP4) 和血管内皮生长因子 A  (VEGF-A) 的刺激下，内皮细胞在中胚层祖细胞中产生，并组成原始管状网络。

随后，在血管生成的过程中，原有的神经丛进行重塑，新的血管发芽和分支，直到一个成熟的循环网络形成^【2】。

本篇文章基于 Nature protocol^【3】 发表的文章，整理了人类多能干细胞 （hPSCs） 来源的血管类器官培养方案。

培养过程遵循发育原理，依靠上述生长因子进行诱导分化，最终培养成为血管类器官网络。

图1. hPSCs 来源的血管类器官培养方案^【3】

细胞来源

hPSCs

 

培养试剂配方

	hPSCs 培养基	中胚层分化培养基	中胚层分化培养基-2	StemPro-34 SFM 完全培养基	Collagen I  溶液	血管分化培养基	近岸蛋白产品货号
基础培养基	DMEM-F12	50％DMEM-F12	50％DMEM-F12	StemPro-34 SFM	DMEM-F12	StemPro-34 SFM	-
	50％Neuro basal	50％Neuro basal	-
penicillin-streptomycin	1％	1％	1％	1％	-	1％	-
FBS	-	-	-	-	-	15％	-
KnockOut Serum Replacement	20％	-	-	-	-	-	-
Glutamax	1％	0.5％	0.5％	1％	0.5％	1％	-
NEAAs	1％	-	-	-	-	-	-
2-mercaptoethanol	0.007‰	0.007‰	0.007‰	-	-	-	-
Y-27632	50 μM	-	-	-	-	-	-
N2	-	1％	1％	-	-	-	-
B27	-	2％	2％	-	-	-	-
CHIR99021	-	12μM	-	-	-	-	-
BMP-4	-	30 ng/ml	-	-	-	-	在研
VEGF-A	-	-	100 ng/ml	-	-	100 ng/ml	C083
FGF-2	-	-	-	-	-	100 ng/ml	C046
Forskolin	-	-	2μM	-	-	-	-
StemPro-34 nutrient supplement	-	-	-	2.6％	-	2.6％	-
Collagen	-	-	-	-	1.6 mg/ml	-	-
0.1N NaOH	-	-	-	-	0.12％	-	-
HEPES	-	-	-	-	10％	-	-
7.5% Sodium bicarbonate	-	-	-	-	0.8％	-	-
PureCol	-	-	-	-	50％	-	-
Matrigel	-	-	-	-	20％	-	-

 

hPSCs培养

1、将冻存的 Matrigel 在 4℃ 下过夜解冻，在 6 孔板的每孔滴加 1ml 冷的 Matrigel，旋动 6 孔板使 Matrigel 分布均匀。随后转移至 37℃ 条件下孵育 10min 使其凝固，使用前需室温静置 1h。

2、将 hPSCs 接种在包被 Matrigel 的 6 孔板中，每孔加入 3ml E8 培养基，放置在 37℃，5%CO₂ 的培养箱中，培养至细胞汇合度约为 75–85%、且大部分无分化的状态时，吸出培养基。

3、向 hPSCs 中加入 0.5 mM EDTA 洗涤细胞一次。

4、吸去 EDTA 溶液，每孔加入 0.6ml Accutase，并将培养皿放置在 37℃ 解离约 3-5min，直到所有的细胞变圆。

5、向每个孔中加入 5ml 的 hPSCs 培养基，并用 0.1% 台盼蓝进行染色计数。

6、将所有细胞转移至 15ml 离心管中，室温下 300g 离心 3min，收集沉淀细胞。6 孔板中每孔接种 2×10⁵ 个细胞，加入预热的 3ml hPSCs 培养基，放置在 37℃，5％CO₂ 培养箱中进行培养。

 

诱导中胚层分化

7、hPSCs 培养 1 天至形成具有平滑边界的聚集体，直径 >50-100 µm 。

8、聚集体形成后，将所有细胞转移至 15ml 离心管中，依靠重力自然沉降（注意：不建议将聚集体离心处理）。静置 15-20min 后，小心吸去培养基上清。

9、将聚集体用 10ml hPSCs 中胚层分化培养基轻轻重悬，加入到低吸附的 6 孔板中，每孔 3ml，放置在 37℃，5％CO₂ 培养箱中孵育 3 天以诱导中胚层分化，培养期间每天用1ml枪头吹打避免过度聚合。

10、重复步骤 8，将培养基替换为中胚层分化培养基-2，放置在 37℃，5％CO₂ 培养箱中孵育 2 天。

 

血管类器官形成

11、将冻存的 Matrigel 在 4℃ 下过夜解冻，在 12 孔板中每孔铺 0.5ml  第一层胶原（1.5mg/ml collagen I+ 25％ Matrigel），轻轻旋转孔板使溶液分布均匀。

12、将 12 孔板放置在 37℃ 条件下固化 2 小时。

13、按照步骤 8 收取细胞沉淀，加入 1ml StemPro-34 SFM 完全培养基清洗细胞一次。

14、计算聚集体的数量，将聚集体用 Collagen I 溶液重悬并置于冰上，调整聚集体的密度为 40-60 个细胞团/50μl。

15、从培养箱中取出含有第一层胶原的 12 孔板，并小心地向 12 孔板的每个孔中添加 0.5 mL含细胞聚集体的 Collagen I溶液。前后晃动平板，使细胞均匀地分布在孔内。

16、将 12 孔板放置在 37℃ 条件下固化 2h。

17、加入预热的 3ml 血管分化培养基，放置在 37℃，5％CO₂ 培养箱中进行培养。血管芽会在培养的 1-3 天出现。培养 3天后换液，之后每隔一天换液一次。

18、大约 10 天后可以将血管类器官固定染色或采用其它方案进行下一步分析。

图 2. 血管类器官的形态^【3】

 

血管类器官的应用前景

血管是血液运输营养物质和氧气的管道，对维持组织和器官的稳态有着重要的作用。目前已知有多种疾病与血管异常有关。

在成年人中，血管功能障碍与中风^【4】、心脏病^【5】、糖尿病^【6】、动脉粥样硬化^【7】、癌症^【8】等主要疾病息息相关。

其次，类器官技术虽然已经日趋成熟，但仍有一些限制阻碍了其更广泛的应用。

目前 3D 培养中的类器官仅依靠被动扩散来交换营养物质、氧气和代谢废物，然而扩散的有效距离通常不超过 300μm，这也导致类器官的中心常常发生坏死。

通过将类器官与血管系统共同培养，可以显著地增加类器官的尺寸和寿命^【9】，图 3 列举了类器官血管化的方案。

我们设想，当类器官血管化这一技术成熟时，它将成为类器官技术应用进一步扩大的宝贵工具。

图 3. 类器官血管化的方案^【10】

 

 

参考文献

【1】Ono, S., & Kabashima, K. Skin Immune System: Microanatomy. 2016, 443-452.

【2】Ferguson III J E, Kelley R W, Patterson C. Mechanisms of endothelial differentiation in embryonic vasculogenesis[J]. Arteriosclerosis, thrombosis, and vascular biology, 2005, 25(11): 2246-2254.

【3】Wimmer R A, Leopoldi A, Aichinger M, et al. Generation of blood vessel organoids from human pluripotent stem cells[J]. Nature protocols, 2019, 14(11): 3082-3100.

【4】Sommer C J. Ischemic stroke: experimental models and reality[J]. Acta neuropathologica, 2017, 133(2): 245-261.

【5】Lu L, Liu M, Sun R R, et al. Myocardial infarction: symptoms and treatments[J]. Cell biochemistry and biophysics, 2015, 72(3): 865-867.

【6】Liu S Q, Fung Y C. Changes in the rheological properties of blood vessel tissue remodeling in the course of development of diabetes[J]. Biorheology, 1992, 29(5-6): 443-457.

【7】Basatemur G L, Jørgensen H F, Clarke M C H, et al. Vascular smooth muscle cells in atherosclerosis[J]. Nature reviews cardiology, 2019, 16(12): 727-744.

【8】Zhang Y, Wang S, Dudley A C. Models and molecular mechanisms of blood vessel co-option by cancer cells[J]. Angiogenesis, 2020, 23(1): 17-25.

【9】Salzmann M, Schmid D, Geiger M. Regulation of Tissue Perfusion and Exchange of Solutes, Macromolecules, and Water Between Blood Vessels and the Interstitial Space[M]//Fundamentals of Vascular Biology. Springer, Cham, 2019: 65-80.

【10】Zhang S, Wan Z, Kamm R D. Vascularized organoids on a chip: Strategies for engineering organoids with functional vasculature[J]. Lab on a Chip, 2021, 21(3): 473-488.