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        肠类器官培养总是失败

        相关实验:🔥 类器官培养

        user-title

        悲伤小萝卜

        按照类器官试剂盒提了数次肠道类器官,但都是失败的,遇到了很多问题,也想了很多办法,但还是失败。不知道有没有什么我没有注意到的细节,求大佬们帮忙看看

         

        我遇到的问题:

        1、提取后有隐窝,但数量不多,按照这个密度铺板隐窝不生长图片描述

        2、容易染菌

        即使加了双抗+庆大霉素+两性霉素,还是在第二到三天就染菌了图片描述

        3、我使用Stemcell商品化的培养基,完全按照他们的说明书和视频操作,但进行到计数的时候(300g 5min),成个体的隐窝就会大量减少,同时单细胞和碎片背景大量增加(而且一点也长不起来)

        图片描述离心前图片描述

        离心后

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        4 个回答

        user-title

        刘小畅FV4X

        有帮助

        同学你好,请问你现在培养有好转吗? 我遇到的问题和你类似,苦恼中…

        user-title

        sswei

        有帮助

        肠类器官培养注意点

        01肠道外部的膜、血管和脂肪,尽量去除干净,否则后续得到的分馏会有很多杂细胞污染;

        02用注射器往肠腔内注入PBS,冲洗掉小肠内容物,可以减少后续洗涤时间;

        03用无菌的载玻片刮去小肠内绒毛组织,尽量去除干净,可以减少杂细胞的产生,另外可以有助于小肠组织的消化,得到更多的小肠隐窝;

        04小肠隐窝消化液用5 mM的EDTA,注意EDTA是否有析出,如析出太多会影响终浓度,有必要更换新的EDTA;

        05因分离小肠隐窝需要时间较久,建议整个操作在低温进行,离心机调至4℃,PBS放冰上。试用移液器前用冷的PBS润洗移液器枪头;

        06EDTA消化后,小肠组织会变松散,在外界机械力作用下,小肠隐窝会从组织中分离出来,可以重复几次通过外界机械力作用得到不同的分馏组分,可以挑选隐窝含量较高,杂细胞较少的分馏组分种板培养;

        07得到分馏组分后进行隐窝计数,用完全培养基重悬隐窝至8~20个/uL,加入等体积基质胶混合,该过程一定要在冰上操作,混合过程切勿产生气泡,否则影响后续观察以及隐窝培养状态,混匀过程可以调小量程,吸取的液体不要全部吹出;


        user-title

        loveliufudan

        有帮助

        有以下几点建议:

        1. 隐窝数量不多:你可以检查提取过程中是否有任何步骤可能导致隐窝的损失。确保在提取过程中注意保护和保存隐窝。另外,你可以尝试使用更高浓度的细胞悬液进行培养,以增加隐窝的数量。

        2. 细菌污染:细菌污染可能来自于实验室环境、操作步骤、培养器具等。确保在实验过程中遵守无菌操作规范,并且彻底清洁培养器具和实验台面。另外,你可以尝试在培养基中添加更高浓度的抗生素来抑制细菌的生长。

        3. 培养基操作问题:确认你在使用Stemcell商品化培养基时是否按照他们的说明书和视频进行操作。如果你遵循了正确的步骤,但仍然出现问题,可能需要与厂家联系,咨询他们的技术支持团队。他们可能能够提供更具体的建议,以解决你遇到的问题。

        user-title

        土井挞克树

        有帮助

        提取隐窝后,适当的提高密度,你的密度比较稀,然后可以用pbs冲洗后再加抗生素

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