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        Annexin V 荧光双染细胞凋亡检测试剂盒实验操作指南

        Elabscience

        905

        Annexin V 是一种钙离子依赖性磷脂结合蛋白,与磷脂酰丝氨酸 PS 有高度亲和力,可通过细胞外侧暴露的PS与凋亡早期细胞胞膜结合,将 Annexin V 标记上荧光染料利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡。

        由于凋亡晚期或坏死细胞膜完整性丧失,细胞核染色液可进入细胞内染色细胞核,搭配 Annexin V 使用可将处于不同凋亡时期的细胞区分开。

        A.悬浮细胞:

        1. 按照实验方案进行凋亡诱导,300 g 离心 5 min,弃上清,收集细胞,用PBS洗涤细胞一次,轻轻重悬浮细胞并计数。
        2. 取 1~5 × 105重悬的细胞,300 g 离心 5 min,弃上清。加入500 μL稀释成 1× 的 Annexin V Binding Buffer 工作液重悬细胞。
        3. 细胞悬液中加入 5 μL 的荧光素标记-Annexin V 和 5 μL 的细胞核染色液。
        4. 轻柔涡旋混匀后,室温避光孵育 15~20 min。
        5. 反应完成后立即上机检测。如不能及时检测,请于冰上避光静置并于 1 h 内完成检测。
        6. 检测

        1)流式细胞仪检测

        处理好的样本在流式细胞仪上检测。

        2)荧光显微镜分析

        取一滴用荧光素-Annexin V/细胞核染色液双染的细胞悬液(4 步骤处理过的细胞悬液)于载玻片上,并用盖玻片盖上细胞。在荧光显微镜下用双色滤光片观察。

        B贴壁细胞

        一、流式细胞仪检测

        1. 按照实验方案进行凋亡诱导,将培养基吸出转移至干净离心管内(待用),用无钙、镁离子的PBS清洗培养瓶细胞一次。
        2. 培养瓶中加入适量的胰酶消化细胞,室温孵育至轻轻吹打可使贴壁细胞脱落,吸除胰酶消化液,避免胰酶消化过度。

        注意:对于贴壁细胞,胰酶消化步骤很关键。胰酶消化时间如果过短,细胞需要用力吹打才能脱落,容易造成细胞膜的损伤,从而导致细胞坏死的假阳性;消化时间如果过长,同样易造成细胞膜损伤而出现细胞坏死的假阳性,甚至会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与 Annexin V-荧光素的结合从而干扰对于细胞凋亡的检测。同时,胰酶细胞消化液中应尽量不含 EDTA,因为EDTA可能会影响 Annexin V 与磷脂酰丝氨酸的结合。

        1. 加入步骤 1中收集的细胞培养液,将细胞轻轻吹打下来,转移到离心管内,300 g 离心 5 min,弃上清,收集细胞,用PBS 洗涤细胞一次,轻轻悬浮细胞并计数。

        注意:加入细胞培养液非常重要,一方面可以收集已经悬浮的发生凋亡或坏死的细胞,另一方面细胞培养液中的血清可以有效抑制或中和残留的胰酶(残留的胰酶会消化并降解后续加入的Annexin V-荧光素,导致染色失败)。

        1. 取 1~5× 105重悬的细胞,300 g 离心 5 min,弃上清。加入500 μL稀释成 1× 的 Annexin V Binding Buffer 工作液重悬细胞。
        2. 细胞悬液中加入 5 μL 的荧光素标记 Annexin V 和 5μL 的细胞核染色液。
        3. 轻柔涡旋混匀后,室温避光孵育15~20 min。
        4. 反应完成后立即上机检测。如不能及时检测,请于冰上避光静置并于 1 h 内完成检测。
        5. 流式细胞仪检测。

        二、荧光显微镜原位检测

        注:本方法优点是可以原位观察细胞凋亡,缺点是部分凋亡由于贴壁不牢而检测不到

        1. 如果条件可以,在诱导凋亡后,用多孔板离心机 300 g 离心 5 min。
        2. 吸除细胞培养液,用 PBS 洗涤两次(如果条件允许,在此前做步骤A)。
        3. 离心后弃上清,加入 500 μL 稀释成 1× 的 Annexin V Binding Buffer 工作液。
        4. 加入 5 μL 的荧光素标记-Annexin V 和 5μL 的细胞核染色液。
        5. 移液器轻轻混匀,室温避光孵育15~20 min。
        6. Annexin V Binding Buffer 工作液洗涤细胞一次
        7. 荧光显微镜检测。在荧光显微镜下用双色滤光片观察。(如果无法观察,可以在孔板下铺上玻片使细胞贴附,最后取出用 Annexin V Binding Buffer 浸润观察。)
        8. 反应完成后应立即观察,取出贴附细胞玻片时,避免细胞干片。
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