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        流式配色基本原则

        Elabscience

        1166

        流式配色遵循以下基本规则:

        强弱搭配

        选择干扰少的荧光组合

        使分析的复杂程度降到最低

        谨慎使用串联染料

        注意环境因素对荧光素的影响

        我们要如何理解这段话呢?

        「强弱搭配」指的是目标 Marker 表达量和荧光素的强度要做到强弱搭配,如果出现强强搭配时,强荧光对弱荧光有干扰的话,那么弱弱组合就像大象身边的狗尾巴草,或者白天的萤火虫,会被完全忽视掉。

        不同于 WB、IHC、IF 或者 ELISA 检测等单指标检测方法,流式实验一般是多指标检测,仪器检测荧光素的时候,可能会被其他荧光素发出的光干扰。高中物理老师说过:「光具有波粒二象性」。

        手机/相机拍照时,只需要「咔嚓」一下,就可以把五颜六色收集到一起;而流式细胞仪以光波的形式,分段接收、检测荧光。

        我们可以回想一下:听收音机的时候,如果有电话打进来,收音机会受到电话信号的无线电干扰,发出「呲呲」的声音。同样地,流式细胞仪在检测某个颜色的光波时,可能会受到相邻颜色荧光信号的干扰,所以,在做流式配色时,我们要「选择干扰少的荧光组合」

        受制于流式细胞仪的配置,出现荧光干扰在所难免。如何将这种影响降到最低呢?

        首先,实验需要设置单阳对照,用于调节补偿。在做数据分析时,为了将这种荧光干扰降到最低,可以考虑将有溢漏的荧光素,放在相互排斥的 Marker 上。

        其次,如果是共表达的 Marker,在表达量高的情况下,是允许溢漏的。

        最后,配色时需要考虑 Marker 的亲子代关系,子代可以向亲代溢漏,亲代不可以向子代溢漏。这么做是为了「使分析的复杂程度降到最低」。

        如果目标 Marker 较少,比如三色、四色等,应尽量选择单体染料(例如:FITC、PE、APC 等)。如果检测 Marker 较多,或者流式细胞仪激光器受限,串联染料(PE/Cyanine5、PerCP/Cyanine5.5 等)的使用,是非常有必要的。

        大部分串联染料,在光照或者实验操作有「固定」步骤时,容易出现降解。所以,在实验过程中,要避免对串联染料进行固定,同时,要严格按照实验标准化流程操作,避免荧光素降解引起的实验问题。

        除了刚才提到的光照和「固定」,容易对串联荧光素造成影响外,串联染料的长期孵育,也会对结果造成影响。因此,细胞染色后,请尽快安排上机检测,特别是在串联染料不便固定时。另外,FITC 对低 pH 环境敏感,如果您的样本 pH 值较低,一定要注意避免使用 FITC 染料。

        关于流式配色的基本原则,就是上面提到的这些。

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