免疫球蛋白提取 (Immunoglobulin isolation)：蛋白定量技术

（一）双缩脲测定法

1 ．原理 蛋白质中的肽键有双缩脲反应，在碱性溶液中与二价铜离子形成蓝紫色的络合物，在一定的范围内，颜色的深浅与蛋白质的含量成正比。此法特异性强，游离的氨基酸、小肽和核酸均不产生这种反应，但此法不够敏感，仅能测出毫克水平。

2 ．试剂配制

硫酸铜（ CuSO₄ · 5H₂ O ） 1.50g

 

 

酒石酸钾钠 5.00g

H₂ O 500.0ml

10 ％氢氧化钠（不含硫酸钠） 300ml

H₂ O 加至 1 000ml

此溶液可长期保存，如产生暗红色沉淀，则应废弃重配。

3 ．标准曲线的制备

⑴ 准确称取牛血清白蛋白 1.0g （必要时须首先采用凯氏定氮法测定牛血清白蛋白制品中实际纯蛋白含量，然后换算），以生理盐水配成 1 ％的浓度。

⑵ 将 1 ％的牛血清白蛋白按表进行稀释：

表 牛血清白蛋白稀释方法表

 

成 分	试 管 号
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
1 ％蛋白液（ ml ）	1.0	.09	0.8	0.7	0.6	0.5	0.4	0.3	0.2	0.1	－
蛋白含量（ mg ）	10	9	8	7	6	5	4	3	2	1	－
生理盐水（ ml ）	0.5	0.6	0.7	0.8	0.9	1.0	1.1	1.2	1.3	1.4	1.5
双缩脲试剂（ ml ）	4.0	4.0	4.0	4.0	4.0	4.0	4.0	4.0	4.0	4.0	4.0
试剂蛋白含量（ mg ）	8.0	7.2	6.4	5.6	4.8	4.0	3.2	2.4	1.6	0.8	0

注： 1 ％牛血清白蛋白，经凯氏定氮测定含纯蛋白为 80 ％。

 

⑶ 混匀后于室温放置 0.5h ～ 1h ，光电比色（ 540nm ），顺序由低浓度至高浓度，每管测 3 次，求其平均值。

⑷ 以 OD 值为纵坐标，蛋白含量为横坐标绘制标准曲线。

4 ．样品测定

⑴ 取样品 0.1ml ，加生理盐水 1.4ml 。也可将样品做 1 ﹕ 10 稀释加 1ml ，再加生理盐水 0.5ml 。

⑵ 加双缩脲试剂 4.0ml ，混匀，至室温 0.5h ～ 1h 。

⑶ 另以 1.5ml 生理盐水加 4.0ml 双缩脲试剂作为空白对照。

⑷ 测 OD₅₄₀ 值。

⑸ 根据 OD 值从标准曲线上查出蛋白含量。

注意：各种双缩脲试剂的配法、加量及室温静置时间均有差异，一旦标准曲线制定后，样品的测定则必须与标准曲线制定的条件一致，否则结果有差异。

（二）紫外光谱吸收法

1 ．原理 本法根据蛋白之中的芳香族氨基酸－色氨酸、酪氨酸在紫外光区的吸收特点而建立的。蛋白质在 280nm 波长附近有一吸收峰，其吸收程度与这些氨基酸的含量成正比。此法灵敏度高，可测到微克水平，操作简单，不需要加各种试剂，测完后，样品可回收。

2 ．标准曲线的制备

⑴ 用精密天平称取牛血清白蛋白 50mg ，溶于 50ml 生理盐水中。

⑵ 以生理盐水再稀释成每 ml 含 0.1mg 、 0.2mg 、 0.3mg 、 0.4mg …… 0.9mg ，以盐水对照。

⑶ 测各管 OD₂₈₀ 值。

⑷ 以 OD₂₈₀ 值为纵坐标，蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线。

3 ．样品测定

将待测样品以盐水适当稀释，在 0.10mg/ml~1.00mg/ml 之间，以生理盐水为对照，测 OD₂₈₀ 值，从标准曲线上查出蛋白含量。

（三） Folin 酚法

1 ．原理 蛋白质中的酪氨酸与色氨酸和 Folin 酚试剂中的磷钨酸、磷钼酸作用后，在碱性条件下不稳定，被还原成蓝色的化合物（钼蓝）。因此通过比色即可测知标本中的蛋白含量。该法的优点是操作简单、灵敏度高，且不受溶液中脂多糖的干扰。

2 ．试剂

试剂甲：

A 液： Na₂ CO₃ 10.00g

NaOH 2.00g

酒石酸钾钠（或钾盐钠盐） 0.25g

混合、溶于 500ml 蒸馏水中。

B 液： CuSO₄ · 5H₂ O 0.5g

H₂ O 100.00ml

用前将 A 液 50 份与 B 液 1 份混合即为试剂甲。

试剂乙：

于磨口回流瓶加入下列试剂

Na₂ WO₄ · 2H₂ O 100.00g

NaMoO₄ · 2H₂ O 25.00g

H₂ O 700.00ml

85 ％ H₃ PO₄ 50.00ml

浓 HCl 100.00ml

按上回流冷凝管以小火回流 10h 后再加：

硫酸锂 150.00g

H₂ O 50.00ml

溴水 数滴

开口继续沸腾 15min ，驱除过量的溴，冷却后溶液呈黄色微带绿色（如仍呈绿色，须重复滴加液体溴步骤）。稀释至 1L ，过滤，滤液置于棕色瓶保存。使用时用标准 NaOH 液滴定，以酚酞为指示剂，然后适当稀释（加水约 1 倍）使最终浓度为 1mol/L 。

3 ．标准曲线的制备

⑴ 取标准牛血清白蛋白 2.50mg ，溶于 10ml 蒸馏水中，使成 250μg/ml 。

⑵ 按表稀释。

表 标准曲线稀释方法

 

成分	试 管 号
1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11
牛血清白蛋白标准品（ ml ）	0	0.2	0.2	0.4	0.1	0.6	0.6	0.8	0.8	1.0	1.0
生理盐水（ ml ）	1.0	0.8	0.8	0.6	0.6	0.4	0.4	0.2	0.2	0	0
蛋白含量 (μg ／ ml)	0	50	50	100	100	150	150	200	200	250	250

⑶ 每管加试剂甲 5ml ，混合后室温放置 10min ，再加 0.50ml 试剂乙（即 Folin 酚试剂），立即摇匀（否则显色降低）。

⑷ 30min 后测 OD₆₅₀ nm 。

⑸ 以 OD 为纵坐标，蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线。

4 ．样品测定

⑴ 待测样品 1ml （适当稀释至约含 25μg － 250μg/ml ）。

⑵ 加试剂甲、乙。

⑶ 比色、测 OD₆₅₀ 值。

⑷ 查标准曲线，求蛋白含量乘以稀释倍数，即为样品的蛋白含量。

（四）紫外分光测定法

A^1% _1cm ＝ 13.8 （ IgG ） (280nm)

A^1% _1cm ＝ 14.5(IgM)(280nm)

蛋白质浓度（ mg/ml ） =1.45OD₂₈₀ － 0.74OD₂₆₀ （此为经验公式，即以不同浓度的蛋白质和核酸混合测定的数值所建立的）。