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        实时荧光定量PCR原理

        互联网

        11372

          所谓实时荧光定量PCR 技术,是指在PCR 反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
        1. 在荧光定量PCR 技术中,有一个很重要的概念—— Ct 值。C 代表Cyclet 代表thresholdCt 值的含义是:每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。
        2. 荧光域值(threshold )的设定

         

        PCR 反应的前15 个循环的荧光信号作为荧光本底信号,荧光域值的缺省设置是3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的10 倍,即:threshold = 10 ´ SDcycle 6-15
        3. Ct
        值与起始模板的关系

         

        研究表明,每个模板的Ct 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,Ct 值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线,其中横坐标代表起始拷贝数的对数,纵坐标代表Ct 值。因此,只要获得未知样品的Ct 值,即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

         

        4. 荧光化学
          荧光定量PCR 所使用的荧光化学可分为两种:荧光探针和荧光染料。现将其原理简述如下:
           1TaqMan 荧光探针:PCR 扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR 扩增时,Taq 酶的5 ’ -3 ’ 外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA 链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR 产物形成完全同步。

         

        2 SYBR 荧光染料:

         

          在PCR 反应体系中,加入过量SYBR 荧光染料,SYBR 荧光染料特异性地掺入DNA 双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR 产物的增加完全同步。

         

         

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