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        DNA碱基序列确定法 DNA sequencing

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        有Maxam-Gilbert法及 Sanger法(又称双脱氧法, Dideoxy法)。前一方法( Maxam-Gilbert ssequencing method)是 1977年发表的方法,又称化学分析法。即把用限制酶切断所得的 DNA片段的 5′末端,再用 32 P标记〔通过使用( r32P ATP和多聚核苷酸激酶〕。然后或将双链分离,或用其它限制酶切断,制出只有双链中的一个链的末端被标记。将这样的 DNA链,通过用碱基特异的化学分解反应,并部分地分解,例如应用与鸟苷残基特异反应进行部分分解,得到从用 32 P标识的 5′末端各鸟苷残基部位分解下来的片段之混合物。关于腺苷、胞苷以及胸苷也可这样得到部分分解产物。将这些部分分解产物并列起来,由聚丙烯酰胺凝胶电泳法根据链长进行分离。电泳后,用放射自显影法将在 5末端含有 32P DNA片段,通过梯状带进行测定。因从 5′末端开始各核苷酸在出现的位置上显出带,所以根据变移率的顺序将带记录,则可了解碱基序列。也有不标记 5’末端, 而是标记 3′末端来作此实验的。又 Sanger法( Sa-nger s sequencing method dideoxy method)因为是利用 DNA聚合酶的修复反应,所以也称为酶法。此法的原理发表于 1975年,但后来曾作了一些改良,从而才形成现在的方法。首先向单链 DNA加入作为引物的短的互补链,制成异源双链,加入 DNA聚合酶(参见科恩伯格酶)和四种脱氧核苷三磷酸,使其从弓吁的 3′末端开始合成 DNA,此时加入少量的 DNA延长抑制剂二脱氧核苷三磷酸时,则在吸入此物质的地方 DNA链的延长便终止。因为二脱氧核苷三磷酸是无规则地被吸收,所以结果从引物形成各种长短的 DNA链。将由于个别加入四种二脱氧核苷酸而合成的反应产物,通过与前述 Maxam Gilbert法同样的凝胶电泳法可分析出碱基序列。用这些方法时,在一个凝胶板上可分析多少碱基序列?这主要依赖于凝胶电泳的分离能力,但在标准条件下可以确定出近 200个碱基序列。

         

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