• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        DNA ladder法

        相关实验:细胞凋亡检测实验

        最新修订时间:

        原理

        发生细胞凋亡时,内源性核酸酶被激活,染色体DNA链在核小体之间被切割,形成180~200个碱基或其整数倍的DNA片段,将这些DNA片段抽提出来进行电泳,可得到DNA梯状条带(DNA ladder)。
         

        材料与仪器

        步骤

        一、材料与试剂准备
         
        1.  材料:凋亡细胞。
         
        2.  蛋白酶K(500 μg/ml), 醋酸钾氯仿(8 mol/L),无水乙醇,70%乙醇,2%琼脂糖凝胶。
         
        3.  白细胞裂解液:pH8.0,10 mmol/L Tris-HCl,10 mmol/L NaCl,10 mmol/L EDTA,1% SDS。
         
        二、操作步骤
         
        1.  收集凋亡细胞:取1~2×106 个细胞,离心后,立即用70%酒精(-20℃)固定2 h。
         
        2.  洗涤:取出酒精固定的细胞,1 000 r/min离心5 min ,去掉上清液,PBS洗二次。
         
        3.  裂解细胞:加400 μl细胞裂解液,充分混匀再加蛋白酶K 100 μl,置65℃水浴消化2小时或过夜。
         
        4.  蛋白处理:加75 μl 8 mol/L的醋酸钾,4℃15 min,再加750 μl氯仿,充分混匀后,10 000 r/min离心10 min后,将上清移至一新的Eppendorf管中。
         
        5.  沉淀DNA:加入750μl无水乙醇,上下轻柔颠倒混合,即可见乳白色沉淀,若不明显时可置-20℃过夜,12 000 r/min离心10 min,去上清。
         
        6.  洗涤DNA:加1 ml 70%乙醇,混匀,10 000 r/min 离心5 min,去上清。
         
        7.  溶解DNA:根据 DAN 沉淀的大小,加一定量的蒸馏水或TE,37℃溶解。
         
        8.  测定DNA浓度。
         
        9.  2%琼脂糖凝胶电泳80 V 2小时。
         
        三、结果判断
         
        出现梯状电泳条带,最小的条带为180~200 bp,其他的条带为其整倍数大小。坏死细胞则出现弥散的电泳条带,无清晰可见的条带。正常细胞DNA基因条带因分子量大,迁移距离短,故停留在加样孔附近。

        来源:丁香实验

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序