• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        从外周血淋巴细胞中提取RNA

        互联网

        3573

        实验试剂

         

        1. Ficoll(Amersham Biosciences)

        2. 冰冷磷酸盐缓冲液(PBS),pH 7.4

        3. 裂解缓冲液:5mol/L单巯基氰酸胍,10mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA),50mmol/L Tris—HCl,1mmol/L二硫苏糖醇(DTT),用0.45微孔滤膜过滤

        4. 4mol/L和3mol/L氯化锂,高压灭菌

        5. RNA溶解缓冲液:0.1%SDS,lmmol/L EDTA,10mmol/LTris—HCl,pH 7.5,高压灭菌

        6. 3mol/L乙酸钠,pH 4.8,焦碳酸二乙酯  (DEPC)  处理  (加0.2ml DEPC/100ml溶液)并灭菌

        7. DEPC处理过的水  (0.2ml DEPC/100ml水),高压灭菌

        8. 用Tris平衡的酚(Sigma)

        9. 氯仿;异戊醇(24:1)(Sigma)

        10. 100%乙醇,-20℃

        实验设备

         

        1. 30m1Corex管,酸洗并硅化

        2. 预冷离心机和吊桶式转头

        实验步骤

         

        1.收集新鲜人血液并立即用Ficoll分离白细胞。

        2.用冰冷PBS洗涤外周血淋巴细胞3次。

        3.在50ml塑料离心管中收集外周血淋巴细胞,并加入7ml裂解缓冲液(可溶解达到5×108 个外周血淋巴细胞),然后剧烈涡旋振荡以溶解细胞。

        4.加入7体积(49m1)4mol/L氯化锂,4℃孵育15~20小时(过夜)。

        5.将悬液转移到30mlCorex管内,在吊桶式转头内4℃离心2小时,6500r/min。

        6.弃去上清,并用Kimwipe擦拭试管口。用3mol/L氯化锂(大约15ml)重悬,收集沉淀.将沉淀重悬液离心,6500r/min 1小时。

        7.弃去上清,用2m1RNA溶解液溶解沉淀。在-20℃下,彻底冷冻悬液。  

        8.复溶悬液,每10分钟涡旋20秒,共45分钟。

        9.用等体积酚抽提1次,并用等体积氯仿抽提1次。

        10.加入1/10体积的3mol/L乙酸钠,pH 4.8和2体积一20℃乙醇。彻底混合溶液,并在-20℃下孵育过夜。

        11.在吊桶式转头内离心RNA,12000r/min 30分钟。用0.2m1DEPC处理水重悬沉淀。将溶解的DNA转移至1.5m1微量离心管内,并加入1/10体积3mol/L乙酸钠,pH 4.8和2体积-20℃乙醇,重新沉淀。并以乙醇沉淀物形式保存RNA,直至准备使用时。

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序