cDNA文库组标准流程一:Total RNA的提取
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1. 试剂配制
准备工作：
1、研钵、5ml/10ml/ 25ml移液管、100ml/250ml量筒、250ml/100ml容量瓶、药匙、 试剂瓶等玻璃制品均用锡纸包裹口部，置于烤箱内,180℃，烤6小时。
2、50ml/1.5ml离心管、枪头等塑料制品用0.1‰DEPC水浸泡过夜后，121℃ 20mins 高压灭菌。
3、电泳槽及电泳托、梳子用3%双氧水处理。
4、常用试剂及其配方：
▲DEPC水：在1000ml去离子水中加入100ul DEPC, 静置过夜后高压灭菌。
▲0.78M柠檬酸纳：PH=4~5
三水合柠檬酸纳 22.94g
加DEPC水定容至100ml，室温放置备用。
▲10%肌氨酸钠：
肌氨酸钠 10g
加DEPC水定容至100ml，室温放置备用。
▲变性裂解液：
0.78M柠檬酸钠 8.25ml
10%肌氨酸钠 12.375ml
异硫氰酸胍 118.05g
加DEPC水定容至 250ml，室温放置备用
临用前加β-巯基乙醇使其终浓度为1%（v/v）
▲ 2M 醋酸钠 PH=4.5
NaAc・3H2 O 13.6g
加DEPC水定容至50ml,高压灭菌，室温放置备用
▲ 3M醋酸钠 PH=5
NaAc・3H2 O 20.4g
加DEPC水定容至50ml,高压灭菌，室温放置备用
▲ 4M LiCL:
LiCL 24.164g
加DEPC水定容至100ml,高压灭菌，室温放置备用
▲0.5M EDTA PH=8.0
EDTA 18.61g
用NaOH调PH值至8.0，定容到100ml，高压灭菌，室温放置备用
▲10X MOPS (3-（N-吗啉代）丙磺酸):
MOPS 41.86g
NaAC・3H2 O 4.10g
0.5MEDTA（PH 8.0） 20ml
用NaOH调PH值 6.5 , DEPC水定容到1L，室温避光放置备用。
▲ 1x MOPS:
10x MOPS 30ml
加DEPC水270ml，用时现配。
▲4x RNA Loading buffer:
10x MOPS 400ul
甘油（高压过） 200UL
溴酚兰 10ul
甲醛(37%) 72ul
去离子甲酰氨 310ul
EDTA(0.5M PH 8.0) 8ul
ErBr(10mg/ml in DEPCH2 O) 70ul
在4℃ 可保持3个月
▲ 10x PBS
pH=7.4
NaCl 80g
KCl 2g
Na2HPO4 14.4g
KH2PO4 2.4g
定容至 1000ml
▲变性电泳胶：
称取0.5g琼脂糖，加入47.5ml 1x MOPs，加热至琼脂糖熔化后，冷却至50℃左右，加入2.5ml甲醛，轻轻混匀后倒入电泳托上。
▲变性电泳缓冲液：
在250ml容量瓶内加入5ml甲醛，用1x MOPS定容至250ml
2. 动物组织 total RNA 的提取
1． 根据表1选择适当的组织量和相应的变性裂解液量，将变性裂解液分装到RNase-free的50ml无菌离心管中，冰浴5分钟。
2． 将组织样品放入变性裂解液中，在高速下匀浆15-30秒/次，直到看不见组织和细胞碎片。
3． 根据表1加入适量2M的乙酸钠（pH4.0），反复颠倒混匀4-5次。
4． 根据表1加入适量酚/氯仿,加盖颠倒混合4-5次，再摇动10秒钟。
5． 冰浴10分钟。
6． 4°C，12000g离心20分钟。
7． 小心转移上层水相于另一个RNase-free的无菌离心管中，内含所需的RNA。蛋白质和DNA分别留在了有机相和中间层。
8． 加入等体积的异丙醇，-20°C沉淀30分钟以上。
9． 4°C，12000g离心20分钟。
10． 根据表1加入适量的变性裂解液重新溶解RNA。
11． 加等体积的氯仿，加盖颠倒混合4-5次，再摇动10秒钟。
12． 4°C，12000g离心20分钟。
13． 小心转移上层水相于另一个RNase-free的无菌离心管中,加入等体积的异丙醇，-20°C沉淀至少30分钟。
14． 4°C，12000g离心20分钟。
15． 弃上清，加1ml75%的乙醇漂洗RNA沉淀。4°C，12000g离心10分钟。
16． 弃上清，空气中干燥RNA沉淀，直至没有乙醇气味。用适量DEPC水充分溶解RNA沉淀。
17． 取少量RNA用于测定OD值及电泳，其余置－80°C冰箱中保存。
表 1
|
Mg# of tissue |
500 |
800 |
1000 |
|
变性裂解液(ml) |
5 |
8 |
10 |
|
2M NaOAC pH 4 (ml) |
0.5 |
0.8 |
1 |
|
水饱和酚 (mL) |
5 |
8 |
10 |
|
氯仿 (mL) |
1 |
1.6 |
2 |
|
异丙醇(mL) |
4 |
6 |
8 |
|
变性裂解液 (mL) |
0.5 |
0.8 |
1 |
|
异丙醇(mL) |
0.5 |
0.8 |
1 |
|
75% 乙醇(mL) |
1 |
1 |
1 |
|
DEPC-treated H2 0 (mL) |
0.5 |
0.8 |
1 |
3. 植物组织total RNA的提取
1. 先将研钵于－80℃冰箱中预冷，然后将1g样品在液氮中研磨成粉末状。
2. 将粉末倒入盛有3ml变性裂解液的50ml离心管中，充分匀浆。（1g样品加入3ml变性裂解液）。
3. 加入0.3ml（1/10体积）2M的NaAc（ph4－5）颠倒混匀。
4. 加入3ml（等体积）的水饱和酚，充分振荡，再加入1ml（1/3）的氯仿，振荡。
5. 冰浴10min。4℃，12000g离心10min
6. 小心转移上清于另一离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，－70℃沉淀至少1小时。
7. 4℃，12000g离心20min。
8. 去上清，取沉淀。加1ml 4M的LiCl 溶解沉淀（1mlLiCl/g组织），并转入1.5ml离心管中。
9. 4℃，13000rpm离心15min。
10. 用0.4ml DEPC水溶解沉淀，加1/2体积的水饱和酚，1/2体积的氯仿，颠倒混匀。
11. 4℃，13000rpm离心10min。
12. 取上清，加1/10体积的3MNaAc（ph5）和2倍体积的无水乙醇，－70℃沉淀30min以上。
13. 4℃，13000rpm离心15min。
14. 弃上清，用1ml 75％的乙醇洗涤沉淀，4℃，13000rpm离心10min。
15. 弃上清，取沉淀，空气中干燥RNA沉淀，直至无乙醇味。
16. 用40－60ul DEPC水溶解(300-500ug/g)RNA沉淀。
17. 取少量RNA用于测定OD值及电泳，其余置－80℃冰箱中保存。
4. TRIzol Reagent 提取total RNA(GIBCO)
1． 查表2根据样品量选择适当的 TRIzol Reagent体积装入50ml RNase-free离心管中，注意样品体积不能超过TRIzol Reagent体积的10%。
2． 将组织样品放入TRIzol Reagent中，高速下匀浆15-30秒/次，直至看不见组织和细胞碎片。
3．室温温育10分钟 。
4． 据表2加入适量体积的氯仿，剧烈震荡15秒钟，然后室温下温育3分钟。
5． 4ºC，12000g离心15分钟，形成淡红色的苯酚/氯仿有机相，中间相和上层水相，水相约占TRIzol体积的60%。
6． 转移上清于另一个Rnase-free的 50ml离心管中。根据表2加入适量异丙醇，-20ºC沉淀1小时以上。
7． 4ºC,12000g离心10分钟。
8． 去上清，据表2加入适量体积的75%的乙醇混匀。
9． 4ºC，7500g离心5分钟。
10． 去上清，空气中干燥或真空抽干RNA沉淀，但不要太干。加入适量体积的DEPC-WATER,溶解沉淀。
11． 取少量RNA用于测定其OD值和电泳，其余置-80ºC冰箱中保存。
表2
|
组织量 |
TRIzol Reagent |
氯仿 |
异丙醇 |
75%乙醇 |
|
50~100mg |
1ml |
0.2ml |
1ml |
1ml |
