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        cDNA文库组标准流程四:载体制备

        互联网

        2000

         

        1 pBlueScriptII 的提取

        1.取1ul商品的pBlueScriptII,转化入大肠杆菌宿主菌中,取5ul转化产物均匀涂布在含AMP的LB平板上,37℃培养过夜。

        2.第二天取一只无菌的50ml离心管,加入10ml AMP抗性的LB液体培养基,挑单克隆于离心管中,37℃,250rpm,培养过夜。

        3.第三天取200µl小摇后的菌液接种于250ml 含AMP的LB液体培养基中,37℃,250rpm培养6 hr左右,使OD值达到0.6-0.8。

        4.将菌液移入250ml离心管中, 4℃,3000rpm,离心15min。取出离心管,菌团朝上倒掉上清,将离心管倒置于吸水纸上使上清充分滤干。(注意离心前需配平)

        5.加入10ml溶液Ⅰ(50mM Glucose , 25mM Tris-HCl,10mM EDTA, pH8.0),加入RNase至终浓度100µg/ml,晃动摇菌,使菌体充分悬浮,静置10min。

        6.按NaOH(0.4N):SDS(2%)--1:1的比例新鲜配制溶液Ⅱ,加入20ml溶液Ⅱ,静置3-5min。

        注: 静置时间勿超过5min,提前将溶液Ⅲ置于冰盒中。

        7.加入15ml冰浴的溶液Ⅲ,冰浴15-30min。

        8.4℃,5000rpm,离心15min。

        9.取上清于两个50ml离心管中,弃去原离心管中的沉淀。

        10.每管加入0.6倍体积的异丙醇,充分混匀,室温下放置10min。

        11. 20℃,12000g,离心20min回收质粒沉淀。

        12.弃上清,用70%的乙醇洗2次。

        13.弃上清,倒扣于吸水纸上,尽量空干液体。

        14.用3ml TE(pH8.0)溶解沉淀,移入1.5ml Eppendorf离心管中。

        15.电泳检查DNA质量并定量。(必要的话,可以用胶回收的方法先纯化一下质粒再进行双酶切。)

        2 .pBlueScriptII的双酶切消化

        1.以如下体系进行EcoRI酶切:

        pBSK(+)                   X µl(6µg)

        ddH2O                     174-X µl

        10×Buffer E                20 µl

        混匀,加入限制性内切酶:

                 EcoRI (10U/ µl)            6 µl  

            总体积为200 µl。

        2.轻弹管壁或用枪头轻轻吹打混匀,在离心机上甩一下。

        3.37℃,水浴1hr。

        4.加入200ul 1:1的酚/氯仿,混匀。4℃,13000rpm,离心15min。

        5.取上清,加入等体积的氯仿,4℃,13000rpm,离心10min。

        6.取上清,加入0.1倍体积的NaAC和2.5倍体积的无水乙醇,-20℃,沉淀30min。

        7. 4℃,13000rpm,离心10min,弃上清,取沉淀。

        8.加入200ul 70%的乙醇洗沉淀。

        9.4℃,13000rpm,离心10min,弃上清,取沉淀。

        10.自然风干沉淀,至无乙醇味,加入100ul ddH2O充分溶解沉淀。

        11.加入以下试剂进行XhoI酶切:

          ddH2O                   74 µl

        10×Buffer D               20 µl

        混匀,加入限制性内切酶XhoI:

                    XhoI (10U/ µl)         6 µl  

        总体积为200 µl。

        12.轻弹管壁或用枪头轻轻吹打混匀,在离心机上甩一下

        13.37℃,水浴1.5hr。

        14.加入200ul 1:1的酚/氯仿,混匀。

        15.4℃,13000rpm,离心15min。

        16.取上清,加入等体积的氯仿,4℃,13000rpm,离心10min。

        17.取上清,加入0.1倍体积的NaAC和2.5倍体积的无水乙醇,-20℃,沉淀30min。

        18. 4℃,13000rpm,离心10min,弃上清,取沉淀。

        19.加入200ul 70%的乙醇洗沉淀。

        20.4℃,13000rpm,离心10min,弃上清,取沉淀。

        21.自然风干沉淀至无乙醇味,加入40ulddH2O充分溶解沉淀,得到双酶切载体。

        3 .载体去磷酸化

        1.在40ul双酶切载体中加入以下试剂:

                      6ul   10×buffer

                      6ul     CIAP(0.01U/ul)

                      8ul    ddH2O

           总体积60ul。

        2.轻弹管壁或用枪头轻轻吹打混匀,在离心机上甩一下。

        3.37℃,水浴1hr。

        4.70℃,15min,灭活酶。

        5.电泳分离,胶回收双酶切载体,定量。

        4 .载体效率检测

        1.按以下所示作4个连接反应:

              

           

        DNA

        连接酶

         

        1

        pBlueScriptII/E/X /CIAP

           -

        检测酶切效率

        2

        pBlueScriptII/E/X /CIAP

           +

        检测脱磷效率,载体自连效率

        3

        商品Vector加标准Insert

           +

        对照

        4

        自制Vector加标准Insert

           +

        检测载体效率

        14℃连接过夜。

        2.  各取1ul连接产物作电转化(具体流程见电转化)

        3.计算克隆数,计算载体相对脱磷效率及连接效率。

         

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