外周血DNA提取技术

方法一：

1. 标本预处理：将1ml EDTA抗凝贮冻血液于室温解冻后移入5ml离心管中，加入1ml磷酸缓冲盐溶液（PBS），混匀，3500g离心15min,倾去含裂解红细胞上清。重复一次。用0.7ml DNA提取液混悬白细胞沉淀，37℃水浴温育1h。
2. 消化：上述DNA提取液混悬白细胞，37℃水浴温育1h后，加入1mg/ml蛋白酶K 0.2ml,至终浓度为100-200ug/ml,上下转动混匀，液体变粘稠。50℃水浴保温3h，裂解细胞，消化蛋白。保温过程中，应不时上下转动几次，混匀反应液。
3. 酚抽提纯化DNA：上述反应液冷却至室温后，加入等体积的饱和酚溶液，温和地上下转动离心管5-10min，直至水相与酚相混匀成乳状液。5000g离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复酚抽提一次。加等体积的氯仿�异戊醇（24�1），上下转动混匀，5000g离心15min，用大口吸管小心吸取上层粘稠水相，移至另一离心管中。重复一次。
4. 加入1/5体积的3mol/L NaAc及2倍体积的预冷的无水乙醇，室温下慢慢摇动离心管，即有乳白色云絮状DNA出现。用玻璃棒小心挑取云絮状的DNA，转入另一1.5 ml离心管中，加70%乙醇0.2ml，5000g离心5min洗涤DNA，弃上清，去除残留的盐。重复一次。室温挥发残留的乙醇，但不要让DNA完全干燥。加TE液20ul溶解DNA,置于摇床平台缓慢摇动，DNA完全溶解通常需12-24小时。
5. DNA的浓度测定及纯度判定：取DNA溶液用TE液做适量稀释，以TE液作空白对照，在紫外分光光度计上读取A260和A280的光密度值。
按下面公式计算浓度： DNA浓度(ug/ul)= A26undefined5undefined稀释倍数/1000
DNA纯度的判定： A260/A280 比值应介于1.7-2.0之间。

方法二：


分别采集外周静脉血5ml，2%乙二胺四乙酸二钠(EDTA)抗凝待用(要求采血至分离白细胞之间隔时间在室温下放置不超过2h，4℃放置不超过5h，以防白细胞自溶)。
采用NaI提取法提取外周血白细胞基因组。
（1）取外周抗凝血（全血）100ul于Ep管中，12000rpm离心12min
（2）弃上清，加双蒸水200ul溶解，摇匀20s
（3）混匀后加6M NaI溶液200ul，摇匀20s
（4）加氯仿/异戊醇（24：1）400ul，即加即摇，摇匀20s，12000rpm离心12min。
（5）取上层液350ul，加入另一新Ep管中，加0.6倍体积异丙醇，摇匀20s，室温放置15min，静置后的反应体系15000rpm离心12min，使沉淀紧贴Ep管壁。
（6）弃异丙醇，加70％乙醇1ml（不振动），15000rpm离心12min。
（7）弃乙醇，敞开Ep管盖， 烘干（37℃恒温箱）后，加1xTE溶液30ul，溶解DNA＞12h以上，制成的DNA液-20℃冰箱保存备用。