引物合成介绍
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5. 需要什么级别的引物？
答：引物常用的纯化方式 C18 脱盐， OPC 纯化， PAGE 纯化， HPLC 纯化。根据实验需要，确定订购引物的纯度级别。
应用 引物长度要求 纯度级别要求
一般 PCR 扩增 < 45base OPC
>45 base PAGE
诊断 PCR 扩增 < 40base OPC, PAGE
DNA 测序 20base 左右 OPC
亚克隆，点突变等 根据实验要求定 OPC, PAGE ， HPLC
基因构建（全基因合成） 根据实验要求定 PAGE
反义核酸 根据实验要求定 PAGE
修饰引物 根据实验要求定 PAGE, HPLC
6. 最长可以合成多长的引物？
答：引物越长，出现问题的概率就越大。我们合成过 120base 的引物，但是产率很低。除非需要，建议合成片段长度不要超过 80mer, 按照目前的引物合成效率， 80mer 的粗产品，全长（还不一定正确）引物的百分比不会超过 40% ，后续处理还有丢失很多，最后的产量是很低。
7. 需要合成多少 OD 数？
答：根据实验目的确定。一般 PCR 扩增， 2 OD 引物，可以做 200-500 次 50ul 标准 PCR 反应。如果是做基因拼接或退火后做连接， 1 OD 就足够了。但是有些研究人员，就做几次 PCR ，但是却要 5-10 OD 。做全基因构建的引物都比较长，但是我们有些研究人员也要求高 OD 数。片段越长 , 最后全长得率就越低，出错的几率就越大。超出需要之外的 OD 数要求，其实也是对社会资源的一种浪费，同时也从一个侧面反映了部分研究人员，特别是新手的自信心不足，总觉得需要重复多次才能成功。
8. 如何检测引物的纯度？
答：实验室方便的作法是用 PAGE 方法。使用加有 7M 尿素的 16% 的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。取 0.2-0.5OD 的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性 (95℃ ,2mins) 。加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。 600V 电压进行电泳，一定时间后 ( 约 2-3 小时 ) ，剥胶，用荧光 TLC 板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。如果条件许可，也可以用 EB 染色或银染方式染色。
9. 如何计算引物的浓度？
答：引物保存在高浓度的状况下比较稳定。引物一般配制成 10-50pmol/ul 。 溶解前您需要核对合成报告单和引物标签上的引物 OD 数是否一致。如果不一致，请和我们联系。我们可以根据生产记录查到实际产量是多少。
一般情况下，我们建议将引物的浓度配制成 50pmol/ul ，加水的体积（微升）按下列方式计算： V ( 微升 )= OD 数
注意： 1 OD260= 33 ug/ml.
10. 如何计算引物的 Tm 值？
答：引物设计软件都可以给出 Tm ，引物长度，碱基组成，引物使用缓冲的离子强度有关。
长度为 25mer 以下的引物， Tm 计算公式为： Tm = 4℃ (G + C)+ 2℃ (A + T)
对于更长的寡聚核苷酸， Tm 计算公式为：
Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) � 600/size
公式中， Size = 引物长度。
Tm 的定义： Tm = Temperature at which 50% of a given oligonucleotide is hybridized to its complementary strand. In the absence of destabilizing agents, like formamide or urea, Tm will depend on 3 major parameters: The sequence: a GC-rich sequence has a higher melting temperature. The strand concentration: high oligonucleotide concentrations favor hybrid formation, which results in a higher melting temperature. The salt concentration: high ionic strength results in a higher Tm as cations stabilize the DNA duplexes.
