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1、 常见的引物修饰和标记的介绍及应用
修饰/标记类型 |
描述 |
应用领域 |
荧光标记引物 |
引物上连接荧光染料或荧光物质,用于可视化实验 |
荧光PCR、原位杂交、荧光探针技术等 |
生物素标记引物 |
引物上连接生物素分子,用于亲和素-双亲和素系统的富集或检测 |
生物素-链酶扩增法(Biotin-ELISA)等 |
磷酸化引物 |
引物中引入磷酸化基团,增强与酶的结合能力 |
PCR扩增、DNA测序等 |
逆转录引物 |
用于逆转录反应,将RNA转录成cDNA的引物 |
RT-PCR、基因表达分析等 |
锚定引物 |
引物上引入锚定序列,用于PCR扩增后的测序特异性结合或适配体连接 |
测序、基因组拼接等 |
化学修饰引物 |
引物上引入化学修饰基团,如甲基化、磷酸化或其他修饰 |
DNA甲基化分析、DNA交联实验、荧光共振能量转移(FRET)等实验 |
2、在修饰/标记引物合成过程中,常见的实验难点及解决方案
①引物纯度和质量控制:
● 使用高纯度的试剂和原料。
● 选择适当的合成方法和纯化技术,如薄层凝胶电泳、高效液相色谱等。
● 进行质量控制检测,如质谱分析、DNA浓度测量等。
②引物修饰效率和位置:
● 优化修饰反应条件,包括修饰试剂浓度、反应时间和温度。
● 选择合适的修饰化学反应或酶法。
● 进行修饰效率的评估和验证。
③引物稳定性和储存:
● 选择稳定的修饰或标记化学基团。
● 存储引物在适当的条件下,如低温和干燥环境。
● 定期检查引物的稳定性和活性。
④引物特异性和选择性:
● 优化引物设计,包括序列选择、引物长度和碱基组成。
● 使用引物设计软件进行特异性分析和评估。
● 进行引物的特异性验证实验,如PCR扩增和测序分析。
⑤引物使用前的测试:
● 进行引物的特异性验证实验,如PCR扩增和测序分析。
● 进行引物的功能性验证实验,如结合实验、放射性标记实验等。
● 使用引物设计软件进行理论分析和预测引物的性能。
3、在修饰/标记引物的设计和分析过程中,有哪些在线工具可以辅助研究人员进行操作和分析
● IDT OligoAnalyzer:由Integrated DNA Technologies (IDT) 提供的工具,用于评估引物的物理特性,如熔解温度、GC含量和二级结构等。网址:idtdna.com/calc/analyzer
● Primer3:用于引物设计的广泛使用的工具,可以根据指定的参数自动设计引物,如引物长度、熔解温度范围和目标序列要求等。网址:bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/
● UCSC In-Silico PCR:通过在基因组数据库中进行模拟PCR来评估引物的特异性,帮助确定引物是否会扩增非特异性产物。网址:genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr
● NCBI Primer-BLAST:由美国国家生物技术信息中心 (NCBI) 提供的工具,用于设计引物和评估其特异性,可以与NCBI数据库进行比对分析。网址:ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
● DNAWorks:用于设计引物和评估引物性能的工具,可以进行引物设计、优化和评估引物的特异性和稳定性。网址:helixweb.nih.gov/DNaworks/
● NEBuilder Assembly Tool:由New England Biolabs提供的在线工具,用于设计和优化DNA片段的引物,并进行引物的限制酶消化和连接设计。nebuilder.neb.com