引物合成介绍

互联网2013-09-06

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11. 引物（含修饰）的分子量是如何确定的？

答：非修饰的引物的 Molecular Weight 在随引物提供的报告单上都有明确的标示。如果需要估计一个引物的分子量按每个碱基的平均分子量为 324.5 ，引物的分子量 = 碱基数 x 碱基的平均分子量。或按下列公式计算 MW= (NA * WA) + (NC * WC) + (NG * WG) + (NT * WT) +(Nmod * Wmod) ＋（ Nx * Wx ） +( Nundefined Wi) +1undefined Ns � 62.

NA, NG, NC, NT, Ni 分别为引物中碱基 A 或 G 或 C 或 T 或 I 的数量， WA, WC, WG, W, Wi 分别为引物中碱基 A 或 G 或 C 或 T 或 I 的分子量， Nmod ， Wmod 分别为修饰基团的数目和分子量。

对于混合碱基的分子量为混合碱基的分子量总合除以混合数，例如 G+A 混合的分子量为（ 313.21+329.21 ） /2 = 321.21 。 Ns 为硫代数目，硫代每个位置增加分子量 16 。

常规碱基分子量

Base Molecular Weight

A 313.21

C 289.18

G 329.21

T 304.19

I 314.2

U 290.17

常规修饰基团分子量

5’ -Biotin 405.45 3’ -TAMARA 623.60

5’ -(6 FAM) 537.46 3’ -Dabsyl 498.49

5’ -HEX 744.13 3’ -(6 FAM) 569.46

5’ -TET 675.24 3’ -Amino Modifier C3 153.07

5’ -Cy5 533.63 3’ -Amino Modifier C7 209.18

5’ -Cy3 507.59 3’ -Thiol Modifier C3 154.12

12. 如何溶解引物？

答：干燥后的引物质地非常疏松，开盖前最好离心一下，或管垂直向上在桌面上敲敲，将引物粉末收集到管底。根据计算出的体积加入去离子无菌水或 10mM Tris pH7.5 缓冲液，室温放置几分钟，振荡助溶，离心将溶液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸馏水，因为有些蒸馏水的 pH 值比较低（ pH4-5 ） , 引物在这种条件下不稳定。

13. 如何保存引物？

答：引物合成后，经过一系列处理和纯化步骤，旋转干燥而成片状物质。引物在溶解前，室温状态下可以长期保存。溶解后的引物 -20 度可以长期保存。如果对实验的重复性要求较高，合成的 OD 数较大，建议分装，避免反复冻融。修饰荧光引物需要避光保存。

14. 合成的引物 5 ’ 端是否有磷酸化

答：合成的引物 5 ’ 为羟基，没有磷酸基团。如果需要您可以用多核苷酸激酶进行 5' 端磷酸化，或者要求我们合成时直接在 5' 或 3' 端进行磷酸化，需要另外收费。

15. 引物片段退火后不能连接到载体上是什么问题？

连接反应需要引物的 5 ’ 磷酸基团。如果需要将合成的引物退火直接连接相应的载体上，引物需要磷酸化。磷酸化的产物如果还不能连接载体上，需要检查载体的酶切效果，需要改善引物退火的条件。 SiRNA 分子具有特殊的对称结构，退火的难度较大，退火时需要提高退火温度。

16. 测序发现引物有突变是怎么回事？

答：测序发现引物区域有突变，特别是 40 个碱基以下的引物 , 发生的概率不大，但是肯定也会发生。用户一般可以放心，引物序列一般都是通过电脑直接将您的序列 COPY 到合成仪的，碱基输错的机会不多。我们有一套控制办法，预防碱基输入错误。发生这种突变的原因有很多解释，人们还没有办法彻底解决这个问题。引物合成的固相合成原理都一样，采用的机器也基本相同，合成主要原料都是由可数的几家跨国公司提供的，所有每个合成服务商遇到的问题也基本类似，没有人可以超脱。

引物合成是一种多步骤的化学反应，合成效率最高也就是 99% ，副产品不可以避免。引物序列中插入突变往往是碱基重复，一般认为，偶连过程中，正在偶连的部分单体发生丢失 DMT, 导致单体又接了上去，故发生插入同一碱基的突变。至于缺失突变，一般认为是一般认为是带帽 (capping) 反应不彻底造成的， Caping 反应主要是封闭极少数 5'- 羟基没有参加反应单体。被封闭的引物，在下一轮偶连时将不能继续参与合成。对于碱基置换的突变，产生的原因一般认为是碱基不能 100% 脱保护，即引物上可能含有残留保护基团，引物的这些区域不能很好地与互补链配对，当扩增的产品被亚克隆转化到大肠杆菌中，可能被细菌中修复系统补上了非配对的碱基。置换突变通常发生在 G 转换成其它碱基。碱基 G 在一定条件下可以转化为烯醇异构体（脱嘌呤）， 2,6 diaminopurine , DNA 复制和扩增过程中 DNA 聚合酶将 2,6 diaminopurine 看作碱基 A ，测序就会发现碱基 G-A 置换。脱嘌呤现象在富含嘌呤的引物中发生的频率较高。脱嘌呤的引物在引物后处理脱保护阶段如果被降解，测序就会发现碱基 G 或 A 的缺失。