引物合成介绍

 

25. 用软件设计的引物为什么不管用？

 

答：引物是否好用，能否扩增出您需要的引物，与是否用软件设计没有太多的关系。引物设计有一定的指导意见，软件就是根据这些要求设计而成。不要迷信软件给您设计的引物，软件中一些参数您可能不明白，弄错了反而麻烦。其实， PCR 扩增的成败最关键的是反应模板的制备和反应条件的控制。软件设计最大的毛病是，有时判断为该基因没有一段区域满足标准引物的要求。有时，我们需要扩增一段基因片段，引物的设计是没有太多的选择的。

 

 

 

 

26. 为什么引物的 OD260/OD280 小于 1.5 ？

 

答：我们多次接到类似的投诉：引物应该全是 DNA, 但是 OD260/OD280 的比值为什么那么低，怎么会有蛋白质污染？遇到这样的投诉有时我们感到很是为难。投诉者有时心情很不好，还不听解释。撇开其他不谈，引物化学合成，哪里有机会污染到蛋白质？

 

    需要指出的是 OD260/OD280 的比值不能用来衡量引物的纯度。 OD260/OD280 的比值过低一般是由于引物中 C/T 的含量比较高所致。下表是一个 20mer 同聚体引物的 OD260/OD280 的比值，清楚表明 OD260/OD280 的比值与引物的碱基组成密切相关。

 

A260/280 ratios of Crude 20-mer Oligos of Differing Base Compositions

 

 

Base Composition   A260/280

 

 

5-AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3     2.50

 

 

5-GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG-3       1.85

 

 

5-CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC-3     1.15

 

 

5-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3     1.14

 

 

5-AAAAAGGGGGTTTTTCCCCC-3    1.66

 

 

 

 

 

27. 同样的 OD 用 PAGE 检测 ， EB 染色为什么深浅不一 ？

 

答 ： 通常可以用 EB 染色的方法来判断双链 DNA 的量 ( 如质粒 DNA) ， 因为 EB 可以嵌合到双链 DNA 中。而合成的单链 DNA ，由于碱基组成不同，形成二级结构的可能性不同， EB 的染色程度也会有差异，比如 Oligo(dT) 等不形成二级结构， EB 染色效果就非常差。所以不要用 EB 染色的方法来定量，而用紫外分光光度计检测。同样道理，用 EB 染色来照片不适合所有引物。

 

 

 

 

28. 引物不纯会有什么后果？

 

答：引物不纯可能会导致： 1) 非特异性扩增； 2) 无法用预先设计在引物 5' 端酶切位点的酶切开，特别是没有保护碱基的引物； 3) 用于测序出现双峰或乱峰。解决办法重新合成或重新纯化。

 

 

 

 

29. 为什么我们的引物重合了几遍都扩增不出来？

 

答：有些 PCR 扩增没有成功，怀疑是引物不好。要求我们重合，没有问题。可是有时遇到重合数次的引物 PCR 扩增还是不成功。这种情况的出现一般都是用户自己的原因。对于引物合成，我们只能做到合成的引物没有问题，至于您是否能够扩增出来您需要的产物，那得靠您自己对实验本身的理解和把握。我们不能杜绝我们不犯错误，但是引物合成犯同样错误的几率很小，想犯同样的错误都难。

 

   PCR 扩增不成功的因素很多，需要您耐心地分析，最好在实验时设置对照来判定原因。

 

如果您怀疑引物的问题，请您首先测定您溶解的引物的 OD 值，看实验时加入的引物量是否正确。如果量是正常的，请您告诉我司您的引物编号，我们会复查留存样品。如不明原因，我们免费为您重新合成一次。如果仍然不能扩增，请您查找其它原因。

 

 

 

 

30. 已经溶解的引物，为什么原先使用正常，而过一段时间再使用就不好了？

 

答：如果您溶解引物的水 PH 过低或污染了菌或核酸酶，会使引物降解。使用时没有充分解冻混合，液体不均匀也可能会造成引物加入量不准确。建议分装引物，避免反复冻溶。建议使用 10mM Tris pH7.5 缓冲液溶解引物，因为因为有些蒸馏水的 pH 值比较低（ pH4-5 ） , 引物在这种条件下不稳定。还有一种可能性是引物没有问题，而是 PCR 使用材料特别是模板的质量与先前使用的不完全一致。

 

 

 

 

31. 引物质量好坏的判断标准是什么？

 

答：合成的引物和您的定单序列一致，而不是能否扩增出您所需要的产物。

 

 

 

 

32. 引物是我们设计的，现在您扩不出来，我们要负责吗？

 

答：不负责任。我们免费为一些实验经验不足的人员，免费设计引物。引物设计好，我们都会发给您确认。设计引物时我们遵循一般的指导原则，但是设计的引物是否能够满足您的实验要求，扩增出您需要的基因片段，我们就不能保证了。我们遇到一些用户，他们讲：引物是你们设计的，也是你们合成的，我做不出，你们就要付责任。听到这样的抱怨，觉得心寒。

 

 

 

 

33.PCR 扩增不出就引物有问题吗？

 

答：基本不是。当今发展出各色各样的 PCR 扩增技术，各色各样的高温聚合酶，就是来解决 PCR 扩增中遇到的扩不出，扩增效率低的问题。如槽式 PCR 就是扩增那些拷贝数很低的基因片段。 有些重复片段的扩增 , GC 含量高的片段，非要采用特殊扩增手段才能扩增出了。

 

   引物扩增不出，主要是下列两种情况比较常见（ 1 ） RT-PCR 。请注意，很多基因通过常规 RT � PCR 方法是很难不增出来的。 RT- PCR 成功的关键在于 RT 的反应的 RNA 质量和目标基因在特定组织和细胞中含量。（ 2 ）从基因组中扩增。一般情况下，基因在基因组中都是单拷贝，基因组作为模板需要严格控制用量。基因组 DNA 过高，会影响反应体系中的 Mg 和 pH 。

 

 

 

 

34.PCR 扩增有很强的非特异条带，说明引物有污染吗？

 

答：不能。瞧，扩增目标很弱或没有，道是非特异性条带很亮，说明引物不纯或有污染。一些用户如是说。我们曾分析过一些非特异条带，测序发现在这些非特异性片段的两头至少可以发现一条引物序列。我们只能说非特异性扩增一般是模板污染（如 RNA 中污染基因组）或扩增条件不合适所致。

 

 

 

 

35. 引物合成的价格合理吗，还有下浮的空间吗？

 

答：不合理。对引物合成的成本，我们做了准确的统计和评估，认为现阶段引物的价格处于一种非理性化状态，价格已基本探底。引物合成的成本主要由四部分组成：（ 1 ）合成原料 （ 2 ）设备折旧 （ 3 ）人员费用 （ 4 ）场地和水电等消耗。其中合成原料占生产成本占 30% ，设备折旧占 30% ，人员费用占 20% ，场地和水电消耗等 20% 。我们的合成成本控制是相当到位，原料管理也非常严格，原料进货成本不可能高于同行。现行的引物合成价格，已让我们感到十分吃力。我们需要对我们的用户负责，我们需要体现做人的准则，我们需要交税，我们需要收回设备的采购费用，我们需要给我们的用户提供配套服务，这些需要才使我们还在做引物合成。引物合成业务的利润空间可能还赶不上菜场上买鱼的。

 

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