随机引物法(利用寡核苷酸延伸法标记DNA放射性)

利用寡核苷酸作引物，DNA 聚合酶可沿单链模板起始 DNA 的合成（Gotilian 1969)。如果寡核苷酸的序列不均一，它们就可在模板的多位点上与模板杂交。因此模板上每一核苷酸（5' 端的核苷酸除外）的互补物将以同样的频率掺入产物。

一、材料

1. 缓冲液和溶液

醋酸氨（10 mol/L）

乙醇

NA 终止/贮存缓冲液（50 mmol/L Tris-Cl (pH 7.5)，50 mmol/L NaCl，5 mmol/L EDTA (pH 8.0)，0.5% (m/V) SDS）

5X 随机引物缓冲液（250 mmol/L Tris (pH 8.0)，25 mmol/L MgCl₂，100 mmol/L NaCl，10 mmol/L 二琉苏糖醇（DTT)，1 mol/L HEPES ( 用 4 mol/L NaOH 调至 pH 6.6），1 mol/L DTT 贮存于 -20℃，临用前用水稀释，使用后弃去稀释的 DTT。）

2. 酶和缓冲液

大肠杆菌 DNA 聚合酶Ⅰ Klenow 片段

3. 凝胶

碱性琼脂糖凝胶或变性聚丙烯酰胺凝胶

4. 核酸和寡核苷酸

含三种未标记的 dNTP 溶液（各 5 mmol/L)

长度为六或七个碱基的随机脱氧核苷酸引物（125 ng/μl TE，pH 7.6）

模板 DNA ( 5~25 ng/μl TE，pH 7.6）

5. 放射性复合物

[α-³²P] dNTP ( 10 mCi/ml，比活性 >3000 Ci/mmol）

6. 专用设备

预热至 95℃ 的沸水浴或加热板

微量离心管（0.5 ml )

SephadexG-50 离心柱，用 TE ( pH 7.6) 平衡

二、方法

1. 在一个 0.5 ml 的微量离心管中加入溶于 30 μl 水的模板 DNA ( 25 ng ) 及 1 μl 随机脱氧核苷酸引物（约 125 ng）。盖紧微量离心管，置于沸水浴中 2 min。

2. 将微量离心管移至冰上放置 1 min，4℃ 下离心 10s 使引物与模板的混合物沉降至管底，将微量离心管重新置于冰上。

3. 在引物与模板的混合物中加入：

5 mmol/L dNTP 溶液       1 μl

5X 随机引物缓冲液         10 μl 

10 mCi/ml [α-³²P] dNTP  5 μl

( 比活性 3000 Ci/mmol）

水                                   加至 50 μl

4. 加入 5 单位（约 1 μl）的 Klenow 片段，轻弹管壁以混合各组分。以最大速度离心 1~2s 使所有液体沉降到管底。反应混合物室温下反应 60 min。

5. 在反应液中加入 10 μl NA 终止/贮存缓冲液，可根据需要进行以下步骤。

贮存放射性标记的探针于 -20℃ 以备杂交用。

或

通过离心柱层析分离放射性标记的探针与未结合的 dNTP 或以乙酸铵和乙醇选择性地沉淀放射性标记的 DNA。如果 >50% 的放射 性 dNTP 已在反应中掺入，可不进行该步骤。