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        Far western检测蛋白质相互作用

        相关实验:蛋白质相互作用检测

        别名:Western blot overlay assay,far-western blotting,protein-interaction assay

        最新修订时间:

        丁香实验推荐阅读

        合作专家 | 郭新容硕士

        临床医学 中南大学

        丁香实验推荐阅读

        审核专家 | 于涛博士

        生物化学分子生物 中国科学院大学

        简介

        Far western 实验主要是利用标记的探针蛋白通过凝胶电泳分离的目的蛋白质,从而探测和检测膜上的目标蛋白与探针蛋白是否具有相互作用。

        原理

        含有 A 蛋白的细胞裂解物中的蛋白质首先被 SDS 或 native PAGE 分离,并转移到膜上,就像在标准 WB中 一样。然后膜中的蛋白质变性并重新变性,用纯化的 B 蛋白封闭和探测膜。

        如果 A 蛋白和 B 蛋白一起形成复合物,则在膜中 B 蛋白所在的斑点上检测到 A 蛋白。与其他生化结合测定相比,Far WB 允许 B 蛋白在不纯化的情况下内源性表达,与大多数使用细胞裂解物(例如,共免疫沉淀(co-IP))或活细胞(例如,荧光共振能量转移(FRET))的方法不同,Far WB 可确定两种蛋白质是否直接相互结合。

        用途

        验证两个目的蛋白之间是否具有直接相互作用。

        材料与仪器

        PBS、SDS-PAGE、PVDF 膜、BSA、PBST

        显色液、待检测蛋白和相应抗体

        SDS-PAGE 电泳仪

        蛋白质标记剂(例如放射性标记剂或荧光标记剂)

        蛋白质转移膜 (例如 PVDF 或 NC 膜、电泳缓冲液

        Western blot 检测试剂盒(例如抗体、辣根过氧化物酶-抗辣根过氧化物酶体系等)

        步骤

        1、准备蛋白质样品将目标蛋白质和探针蛋白质分别制备:将目标蛋白质和探针蛋白质分别加入 SDS-PAGE 电泳缓冲液中,使其浓度达到合适的水平(通常为 1~10 ug/pl)。

        2、将样品加入 PAGE 胶中并进行电泳,电泳时间和电压根据所用的胶和蛋白质分子量而定。电泳结束后将胶从板上取下。

        3、将电泳胶用传输缓冲液在膜上转移。转移时间和电压根据所用的胶和蛋白质分子量而定(100 V 电压转膜,每 1 k Da 蛋白转膜 1 min)。

        4、蛋白质固定: 用 20% 甲醛溶液或热处理方法将膜上的蛋白质固定 30 min。

        5、探针蛋白质的检测:用放射性标记剂或荧光标记剂标记探针蛋白质。将标记后的探针蛋白质加入含有 3% 牛奶粉或 BSA 的 TBST 缓冲液中进行孵育以防止非特异性结合。孵育时间一般为 1~2 小时。

        6、目标蛋白质的检测: 用目标蛋白质作为目标分子,将其加入含有3%牛奶粉或 BSA 的 TBST 缓冲液进行孵育,孵育时间一般为 1~2 小时。然后用 Western blot 检测目标蛋白质是否与探针蛋白质结合。

        7、使用适当的抗体和检测试剂,对膜进行染色和成像,检测目的蛋白和探针蛋白是否定位在同一位置。

        注意事项

        1. 控制膜上探针蛋白质的浓度,避免过多的探针蛋白质覆盖目标蛋白质。

        2. 选择合适的靶蛋白质浓度,避免目标蛋白质浓度过高或过低影响检测结果。

        3. 确保目标蛋白质不会与其他蛋白质相互作用,否则可能会导致假阳性结果。

        4. 选择合适的探针蛋白质,确保其与目标蛋白质具有高亲和力和特异性。

        常见问题

        1. Farwestern 实验中如何选择合适的探针蛋白质?

        答:选择具有高亲和力和特异性的探针蛋白质,最好是已知目标蛋白质的互补 DNA 或 RNA 序列。

        2. Farwestern 实验中如何控制探针蛋白质的浓度?

        答:控制探针蛋白质的浓度,避免过多的探针蛋白质覆盖目标蛋白质。

        3. Farwestern 实验中如何选择合适的靶蛋白质浓度?

        答:需要对不同的靶蛋白质进行优化,以确定最佳浓度。

        4. Far western 实验中如何避免假阳性结果?

        答:确保目标蛋白质不会与其他蛋白质相互作用,选择合适的探针蛋白质,确保其与目标蛋白质具有高亲和力和特异性。

         

        来源:丁香实验

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