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        RNA酶保护试验

        互联网

        2265

         

            RNA酶保护试验((RNase Protection Assay,RPA)是通过液相杂交的方式,用反义RNA探针与样品杂交,以检测RNA表达的技术。与Northern杂交和RT-PCR比较,RPA有以下几个优点:
        1. 检测灵敏度比Northern杂交高。由于Northern杂交步骤中转膜和洗膜都将造成样品和探针的损失,使灵敏度下降,而RPA将所有杂交体系进行电泳,故损失小,提高了灵敏度。
        2. 由于PCR扩增过程中效率不均一和反应“平台”问题,基于PCR产物量进行分析所得数据的可靠性将下降,而RPA没有扩增过程,因此,分析的数据真实性较高。
        3. 由于与反义RNA探针杂交的样品RNA仅为该RNA分子的部分片段,因此,部分降解的RNA样品仍可进行分析。
        4. 步骤较少,耗时短。与Northern杂交相比,省去了转膜和洗膜的过程。
        5. RNA-RNA杂交体稳定性高,无探针自身复性问题,无须封闭。
        6. 一个杂交体系中可同时进行多个探针杂交,无竞争性问题。
        7. 检测分子长度可以任意设置,灵活性大。
            RPA的缺点是需要同位素标记探针。
        一、试剂准备
        1. GACU POOL:取100mM ATP、CTP、GTP各2.78μl、100mM UTP 0.06μl,加DEPC H2 O至100μl。
        2.    杂交缓冲液:PIPES 0.134g、0.5M EDTA(pH8.0)20μl、5M NaCl 0.8ml、甲酰胺8ml,加DEPC H2 O至10ml。
        3.    RNase消化液:5M NaCl 120μl、1M Tris-HCl(pH7.4) 20μl、0.5M EDTA(pH8.0)20μl、RNase A(10mg/ml) 8μl、RNase T1(250U/μl) 1μl,加DEPC H2 O至2ml
        二、 操作步骤
        1.反义RNA可由含T7或SP6启动子的重组质粒为模板制备,也可以用含启动子的PCR产物为模板制备,本文介绍后者。
        1)设计含T7启动子的PCR引物
           由于PCR产物将作为合成反义RNA的模板,所以一对引物中的下游引物5 -端要含T7启动子序列:

         

         

                T7 启动子序列为: 5’-TAATACGACTCACTATAGGG

         

            引物设计的其他要求与一般 PCR 引物的设计相同。 PCR 产物的长度决定了反义 RNA 探针的长度,具体设计时可考虑 100-400bp 长。最好采用巢式 PCR ,即先扩增出一较长的片段,再以该片段为模板扩增出较短的片段,以保证探针的特异性,如下图所示:

         

        <rect> </rect>

        上游引物

         

        <rect> <table> <tbody> <tr> <td> <div> <p class="MsoNormal"> <span>下游引物</span> <span>Ⅱ </span> <span>T7 </span> <span>启动子序列</span></p> <p>  </p> </div> </td> </tr> </tbody> </table> </rect> <rect> <table> <tbody> <tr> <td> <div> <p class="MsoNormal"> <span>下游引物</span> <span>Ⅰ</span></p> <p>  </p> </div> </td> </tr> </tbody> </table> </rect>  

         

         

         

         

         


        2 PCR

           先用上游引物和下游引物 进行 PCR ,再以 PCR 产物为模板 , 用上游引物和下游引物 -T7进行二次PCR(具体操作参见 PCR 章节 )

        3 )探针合成标记与纯化

             0.5ml 离心管中加入下列试剂:

        RNasin (40U/μl)                           0.5μl

         

         

        GACU POOL GAC

         

         

        (含GTP、CTP、ATP各2.75 mM,UTP 61μM)      2μl

         

         

        [ α -32 P ] UTP(10μCi/μl)                        2.5μl

         

         

        DTT (二硫苏糖醇,0.1M)                         1μl

         

         

        5 ×转录 buffer                                 2μl

         

         

        模板(50ng/μl)                             1μl

         

         

        T7 RNA 聚合酶  (15U)                           1μl

         

         

        混合后,短暂离心,37O C保温1hr。

         

         

        加入DNaseⅠ(10U/μl)1μl, 37O C 15min, 然后75 O C 10min以灭活DNAseⅠ和T7 RNA 聚合酶。

         

         

        加入:饱和酚                                50μl

         

         

        氯仿                                  50μl

         

         

        酵母tRNA(2μg/μl)                  4μl

         

         

        DEPC H2 O                              100μl

         

         

          室温下充分混匀,离心10000g×2min。取上层液置另一0.5 ml离心 管中,加入 100 μl氯仿,混匀,离心10000g×2min。将上层液转移至另一0.5ml 离心管中,再加入 3 M NaAc 10 μl 、预冷无水乙醇 250 μl,混匀后,-20O C静置30min。4O C离心13500g×10min。弃上清液,沉淀用75%乙醇100μl洗涤,4O C离心13500g×2min, 弃上清液。室温下挥发残留乙醇。加入50μl杂交缓冲液溶解沉淀,4O C下保存待用。可用尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测探针质量。(参见本节电泳步骤)。

         

         

        2.杂交

         

         

        (1)        RNA提取后溶解在杂交缓冲液中,浓度为1μg/μl。

         

         

        2)取8μl RNA加入1- 3 μl探针(根据探针检测结果调整)于0.5ml 离心管中。

         

         

        (2)        80O C保温2min,然后40- 45 O C下杂交12- 18hr。

         

         

        3. 消化

         

         

        (1) 杂交管于37 O C保温15min,加入RNase消化液,37 O C保温30min。

         

         

        (2) 加入10%SDS 10μl、10μg/μl蛋白酶K 20μl,混匀,37 O C保温10min。

         

         

        (3) 加入65μl饱和酚和65μl氯仿,混匀,室温离心,10000g×2min

         

         

          (4) 转移上层液到另一 0.5离心 管中,加入 10 μl酵母tRNA和 3M NaAc 15 μl,再 加入 200 μl异丙醇,混匀后,置-20O C 30min,4 O C离心,135000g×10min

         

         

        (5)   弃上清液,室温下挥发乙醇,加入 5-8 μl上样缓冲液溶解沉淀。

         

         

        4、电泳与放射自显影

         

         

        1)配制凝胶:(50ml)

         

         

            40%丙烯酰胺-亚甲双丙烯酰胺(19:1)       6.25 ml

                5 × TBE                                  10ml

                尿素                                      24g

        H2 O 50ml

           溶解后加入 25% 过硫酸胺 50 μl TEMED 50 μl, 混匀,注入电泳槽中,插入梳,待胶凝固。

        2 )预电泳

            1 × TBE 为上下槽电泳缓冲液,加上电压后进行预电泳,如果用测序电泳装置,电压应达 2000v 以上,功率设定为 100w ,温度设为 50 O C。待胶板温度达 50 O C时,暂停电泳,准备加样。

         

         

        3)加样

         

         

            将已溶解在加样缓冲液中的样品80 O C加热2min,立即加样到胶孔中,电泳1-2hr。(电泳条件同预电泳)。

         

         

        (3)        电泳结束后,打开胶板,用滤纸取下胶,覆上一层保鲜膜,放置于暗盒中,暗室红光下,压上 一张X片 ,盖上暗盒, -70 O C曝光1-3天。暴光结束后,将X光片显影、定影、水洗、晾干。

         

         

         

         

         

        三、注意事项

         

         

         

         

         

        1.本实验大部分为RNA操作,注意RNA酶的污染。

         

         

        2.RNase消化液消化 未杂交的单链 RNA 和探针 RNA ,当探针与样品之间有碱基错配时,错配位点也将被消化,因此会产生片段较小的杂交片段。因此进行 PCR 时,采取尽量减少错配的措施。

        3、 同位素对 RNA 合成有一定影响,有时会产生非全长的探针。因此,标记时间不宜过长。

        4、 RNase消化液有时会产生过度消化而无检测信号,可以将消化液稀释10-100倍后使用。

         

         

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