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        ELISA法检测细胞凋亡

        互联网

        2682

         

        (一) 原理

         

        细胞凋亡的发生,是由于钙- 镁依赖性核酸酶进入核小体间切割DNA , 产生180bp200bp 或其倍数的核小体片段。而核小体由于与组蛋白H2AH2BH3H4 形成紧密复合物而不被核酸内切酶切割。采用双抗体夹心酶免疫法,应用小鼠抗DNA 和抗组蛋白的单克隆抗体,与核小体片段形成夹心结构,可特异性检测细胞溶解物中的核小体片段。

         

        (二)材料与试剂

         

        1 .采用Boehringer Mannheim 公司试剂盒,生物标记的小鼠抗组蛋白单克隆抗

         

        体。

         

        2 .过氧化物酶(-POD )标记的小鼠抗DNA 单克隆抗体

         

        3 .链霉亲合素包被的微孔板

         

        4 DNA -组蛋白复合物,作为阴性对照。

         

        5 ABTS 底物

         

        6 .溶解缓冲液

         

        7 .温育缓冲液

         

        8 .底物缓冲液

         

        (三)样品

         


        1 .培养细胞或离体细胞的裂解物 细胞裂解步骤:收集细胞,离心后,用200µl 溶细胞缓冲液重新悬浮,室温下作用30min

         

         

        2 .培养细胞的上清液

         

        3 .血浆(血清)

         

        (四)操作方法

         

        1 .取样品离心后(1 000r/min,10min, 吸取20µl 上清液,加入链霉亲合素包被的培养板孔中。

         

        2 .另加入80µl 免疫反应试剂 含抗-DNA POD 、抗组蛋白-生物素及温育缓冲液(按1118 混合),室温下孵育2h (置摇床上,250r/min )。

         

        3 .取上清 ,用300µl 温育缓冲液洗涤3 次,小心移去洗涤液。

         

        4 .加入100µl 底物缓冲液,室温下孵育使颜色变化至适合(置摇床上)。

         

        5 .尽快作比色分析(10min20min 内),用底物缓冲液作空白对照,以波长405nm ,参考波长492nm 进行检测。

         

        (五)结果判定

         

        按下列公式计算细胞释放的单/ 低聚核小体片段的特别聚集值:

        注: mU= 吸收值( 10-3 = 双孔吸收值的平均 OD 值-底物 OD 值,若样品的吸 收值超过比色测定范围,应适当稀释后再检测。

         

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