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        备选方案4:夹心ELISA法检测同种型实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        一、附加材料(其他材料见基本方案)

        1. 抗同种型包被抗体:重链特异抗体(抗 μ、α、γ、б、ε)、重链亚类特异抗体(抗 γ1、γ2a、γ2b、γ3、γ4)或轻链同种型特异抗体(抗 γ和 κ)(不可结合显色 剂中的抗体)

        2. 标准同种型抗体(如已知同种型纯化抗体)

        3. 显色剂:碱性磷酸酶标记抗全部免疫球蛋白重链的特异性抗体

        二、实验方法

        1. 用PBSN稀释最适浓度抗同种型抗体,配制成2 μg/ml。

          筛选杂交瘤上清液的 IgG(抗γ),应最先配制识别所有同种型 IgG 亚类的包被 抗体,在随后分析中用特异亚类包被抗体。

        2. 用 50μl 包被抗体溶液包被 Immulon 微量滴定板的每个孔,并封闭(见基本方案,步骤 3〜5)。

        3. 配制大约 500ng/ml 标准同种型抗体溶液作为阳性对照。

        4. 转移 50μ1 的待测样品或标准同种型抗体溶液到抗体包被的孔中。每块板上设阴性对 照孔(即未包被待测样本溶液或对照抗体溶液),室温下孵育 2 h 以上,洗涤(见基 本方案,步骤 7)。

        5. 配制显色剂,最终显色剂溶液大约含 200ng 抗免疫球蛋白/ml。每孔中加入 50ul 碱性磷酸酶标记抗体(包括阳性和阴性对照组),室温下孵育 2 h,洗涤。

        6. 每孔中加入 75μ1 MUP 或 NPP 底物溶液,室温下孵育。定时检查滴定板底物显色作 用(见基本方案,步骤 9; 阳性对照大约 lh),反应弱的孵育数小时后或过夜再行检测。待测溶液需比阴性对照组信号髙出 3 倍以上才可定性为阳性。

        来源:丁香实验

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