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        PVDF膜上蛋白的可逆染色

        互联网

        1407

         

        PVDF 膜上蛋白的可逆染色

           Western 杂交时,为确认蛋白是否转至 PVDF 膜上,可用下列方法对膜上蛋白进行可逆性染色。

        1.      氨基黑染色

        染液:0.5% Amido Black (w/v), 25% isopropanol (v/v) and 10% acetic acid.

        染色:将PVDF膜置于染液中染色数钟,ddH2 O 脱色。

        2. 考马氏亮蓝染色

        染液:0.1% Coomassie Brilliant Blue R-250 (w/v) and 50% methanol (v/v)

        脱色液:40% methanol (v/v) with 10% acetic acid (v/v)

        染色:将PVDF膜置于染液中染色15 min.,脱色液脱色。

        3.丽春红染色Ponceau S
        染液:0.2% w/v Ponceau S in TCA (3% v/v)

          染色:将PVDF膜置于染液中染色5min

          脱色:ddH2 O 脱色

        三、银染

        PAGE胶上蛋白质的银染方法有数百种,其原理相似,具体步骤各不相同。银染为蛋白质的非特异性染色,呈“爆炸性”反应模式,用于蛋白定量时准确性差,但其敏感度高、简便易行,仍被广泛应用。下面列举的这三种方法为常用的双向电泳凝胶染色法,可与质谱兼容。其中方法1敏感性最高,方法3背景最低、对比度好。

        1.      Blam silver staining protocol (Modified)

        程序

        溶液

        时间

        固定

         

        40%ETOH

        10%HAC

        1小时

         

        漂洗

        30%ETOH

        2×20min

        致敏

        0.02%Na2 S2 O3

        1min

        漂洗

        H2 O

        3×20Secs

        染色

        0.1%AgO3 (预冷)

        4℃,20mins

        漂洗

         

        H2 O

        H2 O(更换盘子)

        3×20Secs

        1min

        显色

         

        3%Na2 CO3

        0.05%甲醛

         

         

        漂洗

        H2 O

        20Secs

        中止

        5%Hac

         

        漂洗

        H2 O

        3×10min

        贮存

        1%Hac,4℃

         

        2.      EMBL Silver Staining Protocol

        程序

        溶液

        时间

        固定

         

        50%MeOH

        5%HAc

        20min

         

        漂洗

        H2 O

        2hr或过夜

        致敏

        0.02%Na2 S2 O3

        1min

        漂洗

        H2 O

        2×1min

        染色

        0.1AgNO3 (预冷)

        20min

        漂洗

        H2 O

        2×1min

        显色

         

        2%Na2 CO3

        0.04%甲醛 

         

        中止

        5% HAc

         

        贮存

        1% HAc,4℃

         

        3.      Vorum Silver Staining Protocol

        程序

        溶液

        时间

        固定

         

         

         

        漂洗

         

        致敏

         

        漂洗

        染色

         

         

        漂洗

        显色

         

         

        中止

         

        贮存

        50%MeOH

        12%HAc

        0.05%甲醛

         

        35%EtOH

         

        0.02%Na2 S2 O3

         

        H2 O

        0.2AgNO3

        0.076%甲醛

        H2 O

        6% Na2 CO3

        0.05%甲醛

        0.0004% Na2 S2 O3

        50%MeOH

        12%HAc

        1%HAc,4℃

        2hr或过夜

         

         

         

        3×20mins

         

        2min

         

        3×5mins

        20min

         

        3×5mins

         

         

         

        5mins

          注意事项:

        1.应严格按照操作步骤进行;

        2.显色前最好更换新染色盘;

        3.显色时变为黄色或棕色后立即弃去,更换新鲜显色液,一般来说染一块胶应配制500ml染液。更换2-3次;

        4.市售甲醛的浓度为37%;

        5.三种方法均与质谱兼容,Blum法敏感性高,但背景呈淡黄色,EMBL法次之但背景较低,染色点较黑。Vorum相对不敏感,但背景清晰,信噪比高。

         

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