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        物细胞的脱分化和分化培养

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        一、实验原理
        分化了的植物 根、茎、叶细胞往往具有全能性,在一定条件下进行离体培养,给于一定的营养与激素,可以脱分化为愈伤组织,由愈伤组织制备成细胞悬浮液,在一定的条件下经振荡培养,逐渐形成具有两极性的胚状体,经过进一步的分化培养,给于不同的营养和激素成分,又可以生出完整的小植株。植物的脱分化和分化培养,证明分化了的植物细胞仍具备形成全整植株所需要的全套基因。在一定条件下,活动的基因可以关闭、已关闭的基因又可以重新启动、再行由胚到成熟植株发育过程中有关基因的先后活动程序。
        二、实验目的
        1.通过实验,掌握无菌操作方法,将胡萝卜贮藏根培养成为愈伤组织。
        2.用无菌操作方法,把烟草组织或甘蓝花茎直接培养成分化小植株。
        三、实验材料
        胡萝卜贮藏根每组二根,甘蓝花茎或烟草茎每组二根。
        四、实验器具和药品
        每组铝饭盒3个,大培养皿2套,250毫升烧杯2只,漂白粉过滤液200毫升,70%酒精,酒精棉花,镊子2把,保安刀2把,小镊1把,无菌水。
        脱分化培养基各组6瓶,30毫升/瓶
        分化培养基各组4瓶,30毫升/瓶
        MS培养基:每升中含

        固体培养基:MS液体加0.8%琼脂
        脱分化培养:MS培养基加2,4-D2毫克/升
        BA0.2毫克/升
        分化培养基:1.MS培养基加KT(或BA)2毫克/升
        2.MS培养基加KT(或BA)2毫克/升+IAA0.05毫克/升
        其中KT为激动素、BA为6-苄基嘌呤、IAA为吲哚乙酸(2种分化培养基,采用一种即可)
        五、实验说明
        脱分化培养基和分化培养基的主要区别在于激素的成分和含量上,说明各种激素的出现和含量改变对于植物组织分化起着重要的作用。许多植物从脱分化到分化过程对培养基里激素成份要求严格、有的还要进行液体培养才能重新分化。例如,胡萝卜贮藏根组织,是最早用于研究植物细胞的全能性的材料,至今仍是研究脱分化的好材料,但当胡萝卜组织形成愈伤组织之后,若要它们重新分化,必须经过振荡培养和采用合适的培养基,条件较为复杂。另一些植物,例如烟草的根、茎、叶和甘蓝的花茎等容易进行脱分化和分化培养,不需液体振荡培养可以在固体培养基上直接完成,是两类较好的实验材料。
        六、实验步骤
        (一)操作前用温水和肥皂将手充分擦洗干净,尽量做到不带菌。
        (二)将事先用自来水洗净的烟草茎,甘蓝花茎或胡萝卜贮藏根切成一定的大小(一般茎、根约为2厘米长、宽)。
        (三)完成以上步骤后,又应用70%酒精棉花擦手,以便再行消毒。
        (四)用消毒镊子将根或茎的切段投放到装有70%酒精的大培养皿中浸泡30秒钟。
        (五)切段自酒精中取出后,立即浸泡于装有15%漂白粉精片水溶液的大培养皿中达20秒钟。
        (六)以上组织切段经分别装有无菌水Ⅰ、Ⅱ的铝饭盒各10分钟,进行漂洗,最后置于无菌水Ⅲ中达20分钟以上。
        (七)切段自无菌水中取出后,立即放于9厘米灭菌培养皿中,盖上皿盖,放于灭菌接种箱。
        (八)在灭菌箱中,无菌操作,削去植物茎、根的外部,叶子的边缘。
        (九)把正常部分切成3mm×3mm×1.5mm大小方块,叶组织切成1.5cm×1.5cm方块。
        (十)由小镊子和接种针,在无菌条件下,将组织小块放入盛有脱分化培养基的三角烧瓶中,每瓶放5—6茎,根组织块或3—4块叶片组织块。挂上标签,写明日期,组号。
        (十一)20℃—25℃避光培养3—4星期后观察。
        (十一)烟草或甘蓝的花茎、长成的愈伤组织,可用同样的无菌操作法,再接种到分化培养基上,3—4星期再进行观察。
        胡萝卜材料要经过液体培养基振荡培养,才能分化(本实验从略)。
        七、实验结果
        (一)观察并记录接种的脱分化培养的组织细胞有无污染?
        (二)愈伤组织细胞是否出现绿色?讨论其来源与影响?
        (三)烟草组织或甘蓝花茎经过分化培养、长出完整的植株,说明什么问题?在理论和实践中有何价值?

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