垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质

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一、试验目的
了解并掌握垂直板凝胶电泳 的使用方法。

二、实验原理
聚丙烯酰胺 凝胶垂直板电泳是以聚丙烯酰胺凝胶做支持物的一种区带电泳，由于此种凝胶具有分子筛的性质，所以本法对样品的分离作用，不仅决定于样品中各组分所带净电荷的多少，也与分子的大小有关。其次，聚丙烯酰胺凝胶电泳还有一种独特的浓缩效应，即在电泳开始阶段，由于不连续pH 梯度的作用，将样品压缩成一条狭窄区带，从而提高了分离效果。
聚丙烯酰胺凝胶具有网状立体结构，很少带有离子的侧基，惰性好，电泳时，电渗作用小，几乎无吸附作用，对热稳定，呈透明状，易于观察结果。
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂亚甲基双丙烯酰胺(简称Bis)在催化剂的作用下，聚合交联而成的含有酰胺基侧链的脂肪族大分子 化合物。
三、仪器和试剂
仪器
电泳仪、垂直平板电泳槽、微量注射器、灯泡瓶、移液器、染色与脱色缸、量筒、滴管。
试剂
1. 丙烯酰胺(单体，简称Acr)
2. 1%琼脂
3. N，N，N，，N，—四甲基乙二胺(TEMED)
4. N，N，—亚甲基双丙烯酰胺(交联剂，简称Bis)
5. 过硫酸铵(聚合时的催化剂)
6. 试剂A(pH8.9)：36.6g 三羟甲基氨基甲烷(Tris)和48mL 1mol/LHCl 混合加水至100mL
7. 试剂B(pH 6.7)：5.98g Tris 和48mL 1mol/LHCl 混合加水至100mL
8. 电极缓冲液：6.0gTris 和28.8g 甘氨酸混合加水至1000mL，用时稀释10倍
9. 0.05%溴酚蓝
10. 20%甘油
11. 7%醋酸
12. 1mol/LHCl
13. 蛋白样品：人或动物血清
四 、操作步骤
1.垂直平板电泳槽的安装
先把垂直平板电泳槽和两块玻璃板洗净，晾干。通过硅胶带将两块玻璃板紧贴于电泳槽(玻璃板之间留有空隙)，两边用夹子夹住。将1%琼脂糖融化，冷至50℃左右，用吸管吸取热的1%琼脂沿电泳槽的两边条内侧加入电泳槽的底槽中，封住缝隙，冷后琼脂凝固，待用。
2.凝胶的制备
(1)分离胶的制备
称取Acr3.2g，Bis16mg，过硫酸铵16mg 一起置于灯泡瓶中，然后加入试剂A2mL，水14mL，摇匀，使其溶解，然后用真空泵抽气10min，以防止分离胶中的氧气妨碍胶的聚合，随后再加TEMED2滴(滴管内径小于2mm)，混匀。用吸管吸取分离胶，沿壁加入垂直平板电泳槽中，直至胶液的高度达电泳槽高度的2/3左右，上面再覆盖一层水或正丁醇(防止氧气扩散进入凝胶抑制聚合)，室温下静置约1h 即可聚合。(注意：丙烯酰胺有毒，应避免皮肤直接接触。)
(2)浓缩胶的制备
称取Acr0.12g，Bis6mg，过硫酸铵16mg，试剂B0.4mL，水2.8mL，摇匀后抽气10min，加TEMED1滴，混匀。用吸管吸取浓缩胶加到分离胶的上面，直至胶的高度为1.5cm，这时将梳板插入，注意梳齿边缘不能带入气泡，室温下静置约0.5～1h 即可聚合。观察梳齿附近凝胶中呈现光线折射的波纹时，浓缩胶即凝聚完成。将梳子拔出后，用电极缓冲液冲洗梳孔。
(3)加样
用微量注射器分别吸取10mg/L 的标准蛋白样品50ul，上面加20%甘油1滴，溴酚蓝指示剂1滴，再用滴管小心加入少量电极缓冲液使之充满梳孔。
(4)电泳
将电极缓冲液分别倒入上下电泳槽，接通电源，调节电压为300V，待溴酚蓝移至凝胶底部1～1.5cm时，切断电源。
(5)染色
将凝胶从玻璃板上取下，放入染色缸中染色20～30min，然后放入7%醋酸中脱色至背景脱尽为止。
(6)鉴定
根据染色所出现的区带，分析样品的纯度。