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        SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质

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        一、目的要求
        1.学习电泳原理和技术
        2.学习和掌握SDS-聚丙烯酰胺 凝胶垂直板电泳分离蛋白质技术
        二、原理
        聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide,简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N,N—methylene-bisacylamide,简称Bis)在加速剂N,N,N,N—四甲基乙二胺(N,N,N,N—tetramethyl ethylenedia mine,简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammonium persulfate (NH4)2S2O8,简称AP)或核黄素(ribofavin即vita min B2,C17H20O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶,以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳 (polyacrylamide gel electrophoresis,简称PAGE)。
        聚丙烯酰胺凝胶有下列特性:
        (1)在一定浓度时,凝胶透明,有弹性,机械性能好;
        (2)化学性能稳定,与被分离物不起化学反应,在很多溶剂中不溶;
        (3)对pH和温度变化较稳定;
        (4)几乎无吸附和电渗作用,只要Acr纯度高,操作条件一致,则样品分离重复性好;
        (5)样品不易扩散,且用量少,其灵敏度可达10-6g
        (6)凝胶孔径可调节,根据被分离物的分子 量选择合适的浓度,通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径;
        (7)分辨率高,尤其在不连续凝胶电泳中,集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。

        凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关。
        表3.4 分子量范围与凝胶浓度的关系

        聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统与不连续系统两大类。
        目前常用的多为圆盘电泳(如图1)和板状电泳(如图2),两者电泳原理完全相同。

        图1 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图 (A为正面,B为剖面)
        (1)样品胶pH6.7 (2)浓缩胶pH6.7 (3)分离胶pH8.9 (4)电极缓冲液pH8.3


        图2 夹心垂直板电泳槽示意图 图3 凝胶模示意图
        1.样品槽模板 2.长玻璃板 1.导线接头 2.下贮槽 3.凹形橡胶框 4.样品槽模板 5.固定螺丝 6.上贮槽 7.冷凝系统


        不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶,凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HC1。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶,凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HC1。电极缓冲液是pH8.3 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性,这是样品浓缩的主要因素。

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