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        猪瘟单克隆抗体ELISA

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        相关专题
         
        (一)材料及试剂
        1.猪瘟单抗纯化抗原
        2.兔抗猪IgG酶标抗体
        3.猪瘟阳性血清
        4.猪瘟阴性血清
        1~4均由指定的生物制品所购买。
        5.ELISA反应板
        6.包被液
        碳酸钠 1.50g
        碳酸氢钠 2.93g
        H2O加至 1 000ml
        pH值9.6
        7.PBS
        氯化钠 8.90g
        磷酸二氢钾 0.20g
        无水磷酸氢二钠 2.13g
        加双馏水 1 000ml
        8.PBS-吐温洗涤液
        PBS液 1 000ml
        犊牛血清 5ml
        混合即可
        9.底物溶液
        ⑴ 0.1Mol/L柠檬酸液
        柠檬酸 21g
        双蒸馏水加至 1 000ml
        ⑵ 0.2Mol/L Na2HPO4液
        Na2HPO4·12H2O 71.6g
        双蒸馏水 加至 1 000ml
        ⑶ pH5.0磷酸盐-柠檬酸缓冲液
        取⑴液 24.30ml
        ⑵液 25.70ml
        混匀即可
        ⑷邻苯二胺液
        取⑶液 50ml
        双馏水 50ml
        磷苯二胺 20mg
        30%H2O2 0.15ml
        待邻苯二胺溶化后再加H2O2,现用现配。
        10.终止液
        浓H2SO4(98%) 22.2ml
        H2O 177.80ml
        (二)操作方法
        1.用包被液将猪瘟弱毒单抗纯化酶联抗原、猪瘟强毒单抗纯化酶联抗原各做100倍稀释,每孔包被100µl,4℃湿盒过夜。
        2.次日取出,甩去孔内液体,3×3′冲洗。
        3.将待检血清以PBS液做400倍稀释,每孔加100µl同时将猪瘟阳性血清、猪瘟阴性血清各做100倍稀释,于对照孔中加100μl。37℃温育1.5h~2h。
        4.重复第二步,取出,甩去孔内液体,3×3′洗涤。
        5.将兔抗猪IgG酶标抗体以PBS液做100倍稀释,每孔加100μl,37℃温育1.5h~2h。
        6.重复第4步。
        7.每孔加底物溶液100µl,室温下观察显色反应。当阴性对照孔稍显色时,立即终止反应,并以阴性孔做空白对照。
        8.每孔加终止液50µl立即于酶联免疫 吸附检测仪测定490nm波长的光密度。
        (三)结果判定
        在猪瘟弱毒酶联板上,OD≥0.2,为猪瘟弱毒抗体阳性;OD<0.2,为猪瘟弱毒抗体阴性。
        在猪瘟强毒酶联板上,OD≥0.5,为猪瘟强毒抗体阳性;OD<0.2,为猪瘟强毒抗体阴性。
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